ICS 65.020.01 CCS B 05 13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 5524—2022 抗豆象绿豆品种真实性和纯度鉴定 SSR 分子标记法 2022 - 02 - 28 发布 2022 - 03 - 31 实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB 13/T 5524—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由河北省农业农村厅提出。 本文件起草单位：河北省农林科学院粮油作物研究所。 本文件主要起草人：刘长友、田静、范保杰、曹志敏、王彦、王珅、苏秋竹、张志肖、王学清、 刘少兴、彭秀国、刘阳。 I DB 13/T 5524—2022 抗豆象绿豆品种真实性和纯度鉴定 SSR 分子标记法 1 范围 本文件规定了SSR分子标记法鉴定抗豆象绿豆（Vigna radiata L.）品种真实性和纯度的仪器设 备及试剂、供试样品、方法步骤和结果判断与计算方法。 本文件适用于抗豆象绿豆品种真实性和纯度的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.1 农作物种子检验规程总则 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程扦样 GB/T 3543.5 农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 绿豆象(Callosobruchus Chinensis) 绿豆象为鞘翅目、豆象科（Bruchidae)的一种昆虫，又叫中国豆象、小豆象、豆牛，在我国各地 均有发生，主要危害绿豆、小豆、豇豆等。 抗豆象绿豆品种(Bruchids Resistant Mungbean Variety) 在人工接种豆象鉴定的条件下，种子被害率小于65%的绿豆品种。 标准样品 （Standard Sample） 国家指定机构保存的经认定代表品种特征特性的实物种子样品。 品种真实性(Varietal Genuineness) 供检品种与该品种的标准样品是否相符。 品种纯度(Varietal Purity) 品种在特征特性方面典型一致的程度，用与供检品种标准特征特性表现一致的本品种的种子数 占样品种子总数的百分率表示。 SSR 分子标记（Simple Sequence Repeats Marker） 也称为微卫星DNA(Microsatellite DNA)标记，是基于单个微卫星位点的重复单元在数量上的变 异而发展起来一种分子标记。微卫星中重复单位的数目在不同材料中存在高度变异，但其两侧的序 列一般是相对保守的单拷贝序列，根据这一特征设计引物进行PCR扩增，从而可以将单个微卫星位 点扩增出来。由于重复单元的重复数目不同就产生扩增片段长度的多态性，从而形成分子标记。 核心引物（Core Primers） 从大量引物中筛选出的一组扩增稳定、多态性较好、带型分布合理、能够用于区分不同材料遗 传背景差异的引物组合。 2 DB 13/T 5524—2022 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR） 在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，是一种在 体外快速扩增特定基因或DNA片段的方法。 4 仪器设备及试剂 仪器设备 高速离心机；PCR 扩增仪；高压电泳仪（3000 V, 400 mA, 400 W）；DNA 序列分析电泳槽；电子 天平（0.01 g, 0.001 g）；研钵或组织研磨仪；水浴锅；通风橱；微量加样器（0.5 μL～10 μL, 20 μL～200 μL, 100 μL～1000 μL）；磁力搅拌器；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；酸度计；冰箱； Nanodrop2000分光光度计；烧杯；镊子；量筒；容量瓶（500 mL，1000 mL）；离心管（1.5 mL，2 mL）； 吸头(10 μL，200 μL，1000 μL)；96 孔 PCR 板；封板膜；一次性手套；离心管架；染色盒；水平仪； 夹子等。 试剂 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；氯化钠；三氯甲烷（氯仿）；异戊醇；β-巯基乙醇；三羟甲基 氨基甲烷（Tris 碱）；37% 浓盐酸；乙二胺四乙酸二钠 ( Na2EDTA-2H 2O)；氢氧化钠；硼酸；40%非 变性聚丙烯酰胺母液（19:1）；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵；硝酸银；甲醛；乙醇。 注：所有试剂均为分析纯 溶液配制 DNA 提取及电泳相关试剂储备液配制见附录B。试剂配制所用水应符合GB/T 6682规定的一级水 的要求，其中银染、显影溶液的配制可以使用符合三级水的要求。 5 样品 送样 送验样品为种子，重量应不低于500 g。 试验样品 从送验样品中随机分取规定数量的试样，试样的分取符合GB/T 3543.2的规定。品种真实性鉴定 试样采用混合试样，混合试样应至少含有15个个体；纯度鉴定试样不少于100粒种子；检测样品可以 是种子、胚芽、幼苗或叶片。 6 方法步骤 DNA 提取 6.1.1 取参试样品种子，利用研钵或组织研磨仪研成粉末，置于 2 mL 离心管中，加入 800 μL 65 ℃ 预热的 2% CTAB DNA 提取液(配方见表 B.3)，涡旋震荡 1 min。 6.1.2 将离心管置于 65 ℃水浴 40 min，每 10 min 颠倒混匀一次。将样品从水浴锅中取出，静置 片刻，加入 800 μL 氯仿与异戊醇的混合液（24 氯仿:1 异戊醇），混匀 15 min，然后静置 10 min， 10000 r/min 室温离心 10 min。 6.1.3 取 600 μL 上清液于另一新的 2 mL 离心管中，加入 900 μL 95%乙醇，-20 ℃放置 30 min 。 10000 r/min 离心 10 min，倒掉上清液，留沉淀。 6.1.4 加入 500 μL 75%乙醇，轻轻将沉淀弹起，10000 r/min 离心 5 min，倒掉上清液。 6.1.5 重复步骤 6.1.4 一次。 6.1.6 将离心管开口朝下倾斜放置，便于多余乙醇流出，室温干燥 1 h 或 50 ℃烘干 20 min。加入 150 μL 灭菌 ddH2O 或 1×TE（配方见表 B.4），置 65 ℃水浴锅溶解 1 h。 3 DB 13/T 5524—2022 6.1.7 取出离心管，放置至室温，10000 r/min 离心 2 min，将上清液吸取到新的 1.5 mL 离心管 中，以便去除淀粉等沉淀物。 6.1.8 利用超微量核酸蛋白检测仪进行 DNA 浓度测定和质量检测，其 OD260 与 OD280 的比值应介于 1.7～2.0 之间，并稀释到 20 ng/μL 备用。 PCR 扩增 6.2.1 PCR 反应体系 利用本标准附表A.1中给出的30对绿豆SSR核心引物对受检样品DNA 及标准样品DNA进行PCR 扩 增。在冰盘中或4 ℃条件下按表 1 所列成分和用量, 依次加入PCR管, 准备PCR反应体系。 表 1 PCR 反应体系 用量 成份 μL DNA 模版（20 ng/μL） 4 正向引物（2 μmol/L） 1 反向引物（2μmol/L） 1 2×UTaq PCR MasterMix 10 ddH2O 4 总体积 20 注：2×UTaq PCR MasterMix 包含 Utaq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液，浓度为 2×，含溴酚蓝和二甲苯 青电泳指示剂 6.2.2 PCR 反应程序 按表 2 程序设置 PCR 反应流程。 表 2 PCR 反应程序 反应步骤 程序设定 反应时间 1 95 ℃ 预变性 5 min 2 95 ℃ 变性 30 s 3 55 ℃ 退火 45 s 4 72 ℃ 延伸 45 s 5 循环次数 35 次 6 72 ℃ 延伸 10 min 备注 不同 SSR 引物所需的退火温度有差异 从步骤 2 到步骤 4 的循环次数 PCR 产物电泳分析 6.3.1 电泳玻璃板准备 电泳采用340 mm×110 mm电泳玻璃板，用洗涤剂仔细清洗, 自来水漂洗干净, 然后用蒸馏水冲洗, 最后用75% 乙醇擦拭, 并空置晾干。 6.3.2 胶板制备 采用8%（w/w）非变性聚丙烯酰胺凝胶，其配制方法见附录B表（表B.5）。取40 mL 8%（w/w） 非变性聚丙烯酰胺胶，加入TEMED 40 μL，10%过硫酸铵400 μL，混匀，灌胶。灌胶完毕后立即插入102 齿高通量制胶梳，放置20 min 以上，以便凝胶完全凝固。 4 DB 13/T 5524—2022 6.3.3 电泳 将胶板组装到电泳槽中，加入0.5×TBE缓冲液。每个样品取1 μLPCR 产物进行点样，同时点DNA marker（最小片段100 bp）作为扩增片段大小的指示标记。设置电泳电压为260 V，每板额定功率30 W；电泳时间根据扩增产物大小进行调整，一般可在二甲苯青指示剂条带刚刚跑出胶板时停止电泳。 6.3.4 银染 下板后将凝胶从玻璃板上取下，用蒸馏水冲洗凝胶1～2次，以洗掉残留的电泳缓冲液。用终浓 度为0.1 %（w/w）的AgNO3染色液染色 10 min。 6.3.5 显影 用蒸馏水冲洗凝胶1～2次，然后使用1.5 %（w/w）NaOH（含0.5%甲醛）溶液进行显影5 min～10 min，然后用蒸馏水充分漂洗凝胶，终止显色反应。 6.3.6 电泳结果记录和分析 6.3.6.1 将凝胶平铺在玻璃板上，用保鲜膜封住，拍照。参照DNA Marker电泳结果，根据每对 SSR 引物从标准样品和检测样品中扩增出的条带数及其分子量大小，按“有”对应条带记录为“ 1 ”，“无” 对应条带记录为“ 0 ”的方法记录每对 SSR 引物的 PCR扩增结果。在引物等位变异片段大小范围内 （见表A.1）,特异谱带呈现单谱带或2种谱带。位于等位变异片段大小范围外的谱带需要甄别是非特 异性扩增还是新增的稀有等位变异。采用单个个体扩增的产物，出现3种或3种以上的多带则为非特 异性扩增；采用混合试样提取的，某些位点出现3种或3种以上的谱带，则需要通过单个个体进行甄 别。 6.3.6.2 品种真实性鉴定采用与标准样品进行比较，对甄别后的特异谱带，在同一电泳板上的供检 样品与标准样品逐个位点比较，确定差异位点。 6.3.6.3 品种纯度采用包括序号12、30的引物在内的10个引物对样品进行分析，当某个体的谱带在 2