ICS 65.020.20 B 16 DB6111 杨凌农业高新技术产业示范区地方标准 DB 6111/T 149—2020 猕猴桃花粉溃疡病菌活菌检测技术规程 Detection of Living Pseudomonas syringae pv. actinidiae from Kiwifruit poLLen 2020 -10 -15 发布 2020 - 11 - 01 实施 杨凌示范区市场监督管理局 发 布 DB6111/T 149—2020 前  言 本文件是依据GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的 规则起草。 本文件由西北农林科技大学提出。 本文件由杨凌农业标准化专业技术委员会归口。 本文件起草单位：西北农林科技大学、陕西省猕猴桃工程技术研究中心、杨凌现代农业产业标准化 研究推广服务中心。 本文件主要起草人：黄丽丽、徐亮胜、雷玉山、高小宁、冯 浩、王娜娜。 本文件由西北农林科技大学负责解释。 本文件为首次发布。 单位：西北农林科技大学 电话：029-87091312 地址：陕西省杨凌区邰成路西北农林科技大学 邮编：712100 I DB6111/T 149—2020 猕猴桃花粉溃疡病菌活菌检测技术规程 1 范围 本文件规定了猕猴桃花粉中活性溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv. Actinidiae，Psa）检测方 法的原理、检测方法、检测样品与菌株保存、结果记录与资料保存的要求和内容。 本文件适用于活性溃疡病菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 23621-2009 农业植物检疫实验室基础条件 SN/T 0168-2015 进出口食品中菌落总数计数方法 SN/T 0800.1-2016 进出口粮油、饲料检验 抽样和制样方法 3 原理 猕猴桃为雌雄异株植物，雌雄株之间必须通过授粉才能坐果，花粉中可以携带活性溃疡病菌。本文 件利用常规生物学鉴定方法和菌落PCR检测方法对花粉中溃疡病菌进行检测，为阻止猕猴桃细菌性溃疡 病菌的传播提供技术支撑。 4 检测方法 4.1 实验室要求 猕猴桃细菌性溃疡病菌检测所用实验室的设置与管理符合GB/T 23621—2009要求。除另有规定外， 本标准中的所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB 6682中一级水的规格。病原菌培养及 鉴定所需试剂见附录B。 4.2 检验程序及鉴定方法 猕猴桃花粉Psa活菌检验程序见图1。 4.2.1 4.2.1.1 操作步骤 检测样品抽取 见SN/T 0800.1-2016。 4.2.1.2 抽样数量 1 DB6111/T 149—2020 10瓶（件）以下，逐瓶抽取，10瓶～100瓶，随机选10瓶抽取样品；100瓶以上，按照一批花粉总瓶 数的平方根数抽取，见公式（1）。每瓶（件）抽取2 g花粉。 ................................................................................... (1) 式中： N—一批花粉总瓶(件)数。 n—应抽取瓶（件）数（取整数，小数部分向上约）。 检 样 稀 释 平板接种 总菌落计数 PCR 确认试验 检测报告 图1 4.2.2 猕猴桃花粉 Psa 活菌检验程序 抽样方法 无菌条件下将装花粉的容器充分震荡，使容器内花粉充分混匀；容器表面用75 %乙醇在包装口擦拭 消毒，待10 min～15 min后，用无菌药匙取2 g花粉于无菌的10 mL离心管中，每瓶（件）花粉需换用1 把药匙。-20 ℃～40 ℃保存备用。 4.2.3 4.2.3.1 样品制备 制备样品匀液 无菌操作称取1 g样品，加入装有9 mL的灭菌双蒸水的和适量玻璃珠的50 mL稀释瓶中，迅速振摇， 将样品混匀，制成1:10的样品匀浆液。振摇时振幅为30 cm，7 s内振摇25次，也可以用机械振荡器振荡 15 s代替手摇。 4.2.3.2 稀释样品匀液 -2 -3 -4 无菌条件下取样品匀液1 mL加到9 mL稀释剂中，并以此类推，分别制成10 、10 、10 连续稀释度 或其它合适稀释度的样品匀液。 4.2.4 2 选择性培养基平板接种和培养 DB6111/T 149—2020 4.2.4.1 无菌条件下各取 1 mL 不同稀释度的样品匀液，均匀涂布在 KBA+萘啶酮酸 （终浓度为 10 μ g/mL）平板培养基上。放入培养箱在 25 ℃培养 1 h 后，翻转培养皿，倒置培养 47 h。观察菌落形态和 病原菌形态特征。猕猴桃细菌性溃疡病菌落和病原菌形态特征见附录 A 第 A.6 章，根据菌落特征选取可 疑菌落做进一步鉴定。 4.2.4.2 KBA 培养基的配制方法为：在培养基中加入蛋白胨 20.0 g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）1.5 g、磷 酸氢二钾（K2HPO4）1.5 g、甘油 10 mL、琼脂粉 15.0 g，并用灭菌双蒸水补充至 1000 mL，将 pH 值调 整到 6.8～7.0。 4.2.5 菌落计数 选择菌落数在25个～250个的平板进行计数，计数所有菌落形成单位（CFU），包括极微小的菌落。 记录菌落数和稀释倍数。如果不能立即计数，平板在0 ℃～4 ℃存放时间不得超过24 h。 4.2.6 4.2.6.1 PCR 检测 从已计数的平板中挑取单菌落进行 PCR 确认试验 平板菌落数小于30个，需全部进行PCR确认；菌落数介于31个～250个时，随机挑取30个菌落进行PCR 确认试验。 注：PCR实验室区的设置与管理符合GB/T 23621—2009要求。 4.2.6.2 热裂解法制备 DNA 模板 用无菌牙签挑取平板上培养36 h～48 h的单菌落，置于200 μL的0.85 %无菌生理盐水中，充分混 匀；在13000 r/min 离心3 min，弃掉上清液；再加入1 mL灭菌双蒸水，充分混匀；置于100 ℃水浴或 金属浴中10 min；冰浴冷却后，13000 r/min离心3 min，收集上清液；按1:10的比例用灭菌双蒸水稀释 上清液即为DNA模板；取2 μL DNA模板进行PCR检测。所有DNA模板可直接用于PCR反应或在4 ℃保存1 天。否则，应在-20 ℃ 以下保存备用(1周内)。 4.2.6.3 阳性对照与阴性对照。 用已知的Psa标准菌株（M228）作为阳性对照；用丁香假单胞杆菌番茄致病变种（Pst）或等效标准 菌株作为阴性对照。灭菌双蒸水作为空白对照。PCR制样及检测方法见附录B的结果判定。 4.2.7 平板培养结果判定 平板培养放置6 d以上,如未发现疑似细菌菌落，判定为不带有Psa。如发现疑似细菌菌落，进行菌 落计数，并做进一步PCR鉴定。 4.2.8 PCR 结果判定 若待测样品和阳性对照存在243 bp条带，阴性对照和空白对照无此条带，则判定待测样品为阳性， 其携带有Psa；否则为阴性。 5 样品与菌株保存 备份样品及从样品中分离到并鉴定为Psa菌株，应妥善保存。备份样品菌株可接种于KBA培养基斜面 上，25 ℃恒温培养2 d～3 d后置于4 ℃冰箱保存，或加入10%体积的甘油制成甘油菌液，置于-80 ℃冰 3 DB6111/T 149—2020 箱长期保存。其它不需要保存的样品及检测过程中产生的废物、废水等应经高压灭菌后集中销毁，用具 也应进行灭菌处理。 6 结果记录与资料保存 实验记录应包括：样品来源、种类（品种）、采集时间、检测时间、地点和结果等，并要有检测人 员、审核人员签字。PCR检测需要有电泳结果照片等，上述材料应归档并妥善保存。 4 DB6111/T 149—2020 AA 附 录 A （资料性附录） 猕猴桃细菌性溃疡病菌（psa）相关资料 A.1 英文名称 Kiwifruit BacteriaL Canker A.2 学名 Pseudomonas syringae pv. actinidiae A.3 分布地区 中国、日本、韩国、新西兰、意大利、美国、法国、葡萄牙、土尔其、西班牙、伊朗、希腊。 A.4 寄主范围 该病原菌自然侵染的寄主主要为猕猴桃属（Actinidia LindL）；人工接种可侵染桃（Prunus persica）、樱桃（Prunus avium）、李（Prunus saLicina）、烟草（Nicotiana tabacum）、番茄（Lycopersicon escuLentum ）等。 A.5 A.5.1 病害症状 枝溃疡症状 多从茎蔓幼芽、皮孔、叶痕、果柄痕及枝条分叉部位开始发病，初期呈水渍状，后扩大，颜色加深， 皮层组织变软隆起，与木质部分离，后期病部皮层纵向线状龟裂，伤口、皮孔、芽眼、叶痕等部位流出 白色黏液，伤流期与植株伤流液混合后变为红褐色或铁锈红色，剥开皮层后可见木质部呈黑褐色，韧皮 部溃疡腐烂，病斑绕茎扩展到新梢后影响营养和水分的吸收与输送导致新梢枝叶萎蔫枯死。 A.5.2 叶斑症状 新生叶片上呈现红色小点，后形成2 mm～3 mm不规则褐色或暗褐色病斑，病斑周围有2 mm～5 mm 的明显水渍状黄色晕圈，潮湿条件下病斑扩大，导致整个叶片焦枯、卷曲。 A.5.3 花腐症状 花蕾受害后严重的不能张开，变褐死后脱落；受害较轻的花蕾虽能开放，但开放速度慢或不能完全 开放，这种花可能脱落也可能座果，通常果实较小，易落果或发育成畸形果。 A.6 病原菌形态特征及培养性状 5 DB6111/T 149—2020 Psa为好氧细菌，病原菌菌体直杆状，有的稍弯曲，单细胞，菌体大小为（1.4 μm～2.3 μm）× （0.4 μm～0.5 μm），多数具1根极生鞭毛，少数为2根～3根。革兰氏染色阴性，不具荚膜，不产生 芽孢。在KBA培养基上菌落呈白色或浅黄色、表面光滑、有黄绿色荧光；在牛肉蛋白胨培养基上呈圆形、 乳白色、表面光滑、全缘。病原菌生长最适温度为25 ℃～28 ℃，生长最高温度为35 ℃，生长最低温 度为-12 ℃以下，致死温度为55 ℃、10 min。 A.7 传播途径 该病原菌的远距离传播主要靠带菌苗木、接穗、花粉和昆虫。在田间，该病原菌主要通过雨水、灌 溉水、农具、昆虫等传播，由伤口、自然孔口等侵入寄主组织。 6 DB6111/T 149—2020 BB 附 录 B （资