ICS 65.020 CCS B 16 DB6111 杨凌农业高新技术产业示范区地方标准 DB 6111/T 172—2021 猕猴桃病毒鉴定技术规程 Technical standard for virus identification in kiwifruit seedlings 2021 - 10 - 22 发布 杨凌示范区市场监督管理局 2021 - 11 - 01 实施 发 布 DB6111/T 172—2021 前  言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》起草。 本文件由西北农林科技大学提出。 本文件由杨凌示范区农业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：西北农林科技大学、陕西省农村科技开发中心。 本文件起草人：赵 磊、徐 明、刘 佩、吴云锋、雷玉山。 本文件由西北农林科技大学和陕西省农村科技开发中心负责解释。 联 系 人：赵磊 联系方式：18792627895 联系地址：杨凌示范区邰城路3号 I DB6111/T 172—2021 猕猴桃病毒鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了猕猴桃病毒鉴定技术的术语和定义、检测对象、取样部位、抽样、鉴定方法和判定规 则。 本文件适用于杨凌示范区猕猴桃母本树、猕猴桃苗木的病毒鉴定。环境相似的猕猴桃产区可参照执 行。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 猕猴桃母本树 stock plant of kiwifruit 提供猕猴桃种条或建外植体所需要幼嫩枝条的猕猴桃母株。 3.2 猕猴桃苗木 Kiwifruit seedling 经扦插、嫁接、组培等方式繁育的猕猴桃种苗。 3.3 逆转录-聚合酶链式反应 Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR） 提取猕猴桃检材的总RNA，以其中的mRNA为模板，利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为 模板进行聚合酶链式反应。 4 检测对象 猕猴桃主要病毒： a) b) c) d) 猕猴桃病毒 A（Actinidia virus A, AcVA）； 猕猴桃病毒 B （Actinidia virus B，AcVB）； 猕猴桃病毒 C （Actinidia virus C，AcVC）； 猕猴桃褪绿环斑相关病毒（Actinidia chlorotic ringspot-associated virus, AcCRaV）； 1 DB6111/T 172—2021 e) f) g) h) i) j) k) l) m) 4.1 黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus, CMV）； 苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus, ASGV）； 马铃薯 X 病毒（potato virus X, PVX）； 柑橘叶斑驳病毒（citrus leaf blotch virus，CLBV）； 猕猴桃病毒 1（Actinidia virus 1，AcV-1）； 猕猴桃褪绿环斑病毒(Actinidia yellowing ringspot virus, AYRSpV）； 猕猴桃黄化病毒 1（Actinidia yellowing virus 1, AcYV1）； 猕猴桃黄化病毒 2（Actinidia yellowing virus 2, AcYV2）； 猕猴桃种传潜隐病毒（Actinidia seed-borne latent virus, ASbLV)。 抽样 4.1.1 猴桃母本树 每株均需检测。 4.1.2 出圃苗木 采用5点取样法随机抽取。1万株以内抽检100株（含1万株）；1万株～10万株（含10万株），首个1 万株抽100株，之后每增加1万株增检50株，不足1万株按1万株计；超过10万株，第1万～10万株按上述 方法抽样，之后每增加1万株增检20株，不足1万株按1万株计。 5 取样部位 生长季节取幼嫩叶片放置于自封袋内，4 ℃保存不超过24 h或放置于-80 ℃长期保存备用；休眠季 节剪下枝条，撕开表皮用小刀刮取1 g左右韧皮部组织，立即使用或放置于-80 ℃保存备用。 6 鉴定方法 6.1 双抗体夹心酶联免疫法（DAS-ELISA 法） 详见附录A。 6.2 逆转录-聚合酶链式反应法（RT-PCR 法） 详见附录B。 7 判定规则 酶联免疫检测或RT-PCR检测呈阳性反应的判定为携带病毒。脱毒母本树带毒率为0、出圃苗木带毒 率≤3.0%判定为合格苗木。 2 DB6111/T 172—2021 AA 附 录 A （规范性附录） 双抗体夹心酶联免疫检测法（DAS-ELISA 法） A.1 溶液配制 A.1.1 所用化学试剂均为分析纯级规格，用水为蒸馏水。 A.1.2 抽提缓冲液 抽提缓冲液的配制见表A.1。 表 A.1 抽提缓冲液的配制 质量 药品名称 注： g 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 60.50 氯化钠（NaCl） 8.00 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）,MW40000 20.00 聚乙二醇 （PEG） 10.00 吐温-20 （Tween-20） 0.50 溶于900 mL蒸馏水中，用盐酸将溶液pH值调整到8.2，再用蒸馏水定容至1000 mL，4 ℃下保存，有效期1年。 A.1.3 洗涤缓冲液 洗涤缓冲液的配制见表A.2。 表 A.2 洗涤缓冲液的配制 药品名称 注： 质量 g 氯化钠（NaCl） 8.00 磷酸氢二钠（Na2HPO4） 1.15 磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.20 氯化钾（KCl） 0.20 吐温-20 （Tween-20） 0.50 溶于900 mL蒸馏水中，用盐酸将溶液pH值调整到7.4，再用蒸馏水定容至1000 mL，4 ℃下保存，有效期1年。 A.1.4 包被缓冲液 包被缓冲液的配制见表A.3。 3 DB6111/T 172—2021 表 A.3 包被缓冲液的配制 质量 药品名称 溶于 900 A.1.5 g 碳酸钠（NaCO3） 1.59 碳酸氢钠（NaHCO3） 2.93 mL 蒸馏水中，用盐酸将溶液 pH 值调整到 9.6，再用蒸馏水定容至 1000 mL，4 ℃下保存，有效期 1 年。 酶标抗体稀释缓冲液 酶标抗体稀释缓冲液的配制见表A.4。 表 A.4 酶标抗体稀释缓冲液的配制 药品名称 质量 g 牛血清蛋白（BSA） 2.00 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）,MW40000 20.00 溶于 900 mL 蒸馏水中，再用蒸馏水定容至 1000 mL，4 ℃下保存，有效期 1 年。 A.1.6 底物缓冲液 底物缓冲液的配制见表A.5。 表 A.5 底物缓冲液的配制 药品名称 质量/体积 六水氯化镁（MgCl2·6H2O） 0.10 g 二乙醇胺（MDEA） 97.00 ml 溶于 900 mL 蒸馏水中，用盐酸将溶液 pH 值调整到 9.8，再用蒸馏水定容至 1000 mL，4 ℃下保存，有效期 1 年。 A.1.7 底物溶液 秤取5 mg 4-硝基苯基磷酸二钠盐（PNP）溶解于5 mL底物缓冲液，现配现用。 A.2 A.2.1 操作步骤 样品制备 取待检样品0.4 g，加入2 mL抽提缓冲液，用研钵研磨至无可见颗粒的糊状，4 ℃，10000 rpm离心 10 min，取上清液备用。 A.2.2 包被抗体 用抗体包被缓冲液，按相应病毒抗体稀释倍数稀释。酶标板每孔加入120 μL抗体稀释液，37 ℃保 湿孵育2 h或4 ℃保湿过夜。 4 DB6111/T 172—2021 A.2.3 洗板 用洗涤缓冲液浸泡洗涤抗体孵育的酶标板3次，每次3 min～5 min。 A.2.4 包被样品 酶标板每孔加110 μL制备的样品，37 ℃保湿孵育2 h或4 ℃保湿过夜。同时设阴性、阳性和空白 对照，设置3次重复。阳性对照为含有目标病毒的材料；阴性对照为不含有目标病毒的健康猕猴桃叶片； 空白对照为包被缓冲液。 A.2.5 洗板 同A.2.3。 A.2.6 包被酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按照酶标抗体说明书的稀释倍数将其稀释，每加样孔加100 μL经过稀释的 酶标抗体，37 ℃保湿孵育2 h或4 ℃保湿过夜。 A.2.7 洗板 同A.2.3。 A.3 加底物 酶标板每孔加入90 μL底物溶液，室温避光反应1 h。 A.4 终止反应 酶标板每孔加入3 mol/L的NaOH溶液50 μL终止反应。 A.5 酶联检测 用酶标仪检测终止反应的酶标板，读取405 nm 的光吸收值（OD405），记录数据。 A.5.1 判断规则 按照表A.6判定结果： 表 A.1 结果判定 项 目 （检测样品OD405-空白对照OD405）/（阴 性对照OD405-空白对照OD405） 指 标 判 定 ≥2.0 阳性 1.5～2.0 疑似阳性 ≤1.5 阴性 注：疑似阳性样品用 RT-PCR 法核验检测确定 5 DB6111/T 172—2021 BB 附 录 B （规范性附录） 逆转录-聚合酶链式反应法（RT-PCR 法） B.1 试剂盒 B.1.1 B.1.2 B.1.3 B.2 植物RNA提取试剂盒：选择适合提取含有多糖多酚材料的RNA试剂盒。 反转录试剂盒：使用市售的商品反转录试剂盒，按照说明进行操作。 PCR扩增试剂盒：使用市售的商品PCR扩增试剂盒，按照说明进行操作。 引物 病毒PCR检测特异性引物见表B.1 表 B.1 病毒 AcV-1 AcYV1 AcYV2 AYRSpV AcVA AcVB AcVC AcCRaV ASGV CMV CLBV PVX ASbLV B.3 B.3.1 6 引物名称 AcV1-CPF AcV1-CPR AcYV1-F AcYV1-R AcYV2-F AcYV2-R AYRSpV-F AYRSpV-R AcVA F AcVA R AcVB5F AcVB5R AcVCF6 AcVCR6 AcCRaV3F AcCRaV3R ASGV-U ASGV-2 CMV F CMV R dCLBV-F2 dCLBV-R2 PVX F PVX R ASbLV-F ASbLV-R 操作步骤 猕猴桃RNA提取 猕猴桃病毒的特异性引物 引物序列 5'-3' TGAGCTRGGRATAGATGTTGC TCTCTCAGGGTTMGGATGAGT CAACGCCGCAAACATCCTTAT CAC