ICS65.020.01 B16 团体标准 T/GDPPS005-2022 烟粉虱传双生病毒病诊断技术规程 TheTechnicalCodeofPracticeforDiagnosticTechniqueofDiseases CausedbyWhitefly-transmittedGeminiviruses 2022-05-25发布 2022-05-25实施 广东省植物保护学会发布 全国团体标准信息平台 T/GDPPS005-2022 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规 则》的规定起草。 本文件由广东省植物保护学会提出并归口。 本文件起草单位：广东省农业科学院植物保护研究所,广东省植物保护新技术重点实验 室。 本文件主要起草人：汤亚飞、何自福、李正刚、佘小漫、于琳、蓝国兵。 全国团体标准信息平台 T/GDPPS005-2022 1烟粉虱传双生病毒病诊断技术规程 1范围 本文件规定了烟粉虱传双生病毒病的术语和定义、田间诊断、实验室诊断、结果判定 等技术要求。 本文件适用于番茄、黄秋葵、南瓜、甘薯、烟草烟粉虱传双生病毒病诊断。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1烟粉虱传双生病毒Whitefly-transmittedgeminiviruses，WTGs 烟粉虱传双生病毒，属双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色黄花叶病毒属 （Begomovirus）病毒，是一类植物单链环状DNA病毒，由烟粉虱（Bemisiatabaci）以持久 方式传播，同时可经嫁接传播，不能经机械摩擦或种子传播。根据基因组类型，烟粉虱传 双生病毒可分为双组分病毒和单组分病毒。双组分病毒含有2个大小为2.5~3.0kb的单链环 状DNA分子（分别称为DNA-A和DNA-B）；单组分病毒含有1个大小为2.5~3.0kb的单链环 状DNA分子，常伴随一些大小约为1.4~1.5kb的卫星分子。 2.2烟粉虱传双生病毒病Diseasecausedbywhitefly-transmittedgeminiviruses 由烟粉虱传双生病毒侵染引起的一类植物病害，田间主要表现植物叶片黄化、卷曲、 黄脉、叶缘黄化、花叶、叶脉深绿色、产生耳突、植株矮化等特征症状。 2.3病害诊断Diseasediagnosis 通过田间观察植株症状表现，进一步在实验室对病原物进行鉴定，根据两者的结果进 行综合分析，做出诊断结论。 3烟粉虱传双生病毒病田间诊断 3.1烟粉虱传番茄双生病毒病田间诊断 烟粉虱传番茄双生病毒病的田间症状：病株矮化，生长缓慢或停滞，顶部叶片常褪绿 发黄、变小，叶片边缘上卷，叶质变硬；植株若生长早期被感染，矮缩严重，无法正常开 花结果；生长后期被感染植株上部叶和新芽表现症状，结果数减少，果实变小，成熟期果 全国团体标准信息平台 T/GDPPS005-2022 2实着色不均匀（参见资料性附录A图1）。若田间番茄表现上述类似症状，且田间有一定数 量的烟粉虱存在或曾有烟粉虱发生，初步判定可能存在烟粉虱传双生病毒病的发生。 3.2烟粉虱传黄秋葵双生病毒病田间诊断 烟粉虱传黄秋葵双生病毒病的田间症状：病株叶片向上或向下卷曲、叶片正面出现网 络状黄色或褪绿条纹，叶背面叶脉肿大突起，叶质脆硬；病株幼叶症状明显、叶小且卷曲， 而老叶症状不明显或不表现症状。植株若早期被感染，明显矮化、叶小、叶脉肿大、结实 数少且果实细小（参见资料性附录A图2）。若田间黄秋葵表现上述类似症状，且田间有一 定数量的烟粉虱存在或曾有烟粉虱发生，初步判定有烟粉虱传双生病毒病的发生。 3.3烟粉虱传南瓜双生病毒病田间诊断 烟粉虱传南瓜双生病毒病的田间症状：病株叶片卷曲，严重时叶背产生许多叶状增生 物。早期感染会导致植株严重矮缩，不能正常开花结瓜（附录A图3）。若田间南瓜表现上 述类似症状，且田间有一定数量的烟粉虱存在或曾有烟粉虱发生，初步判定有烟粉虱传双 生病毒病的发生。 3.4烟粉虱传甘薯双生病毒病田间诊断 烟粉虱传甘薯双生病毒病的田间症状：病株叶片卷曲、皱缩，叶脉黄化及植株矮缩（参 见资料性附录A图4）。若田间甘薯表现上述类似症状，且田间有一定数量的烟粉虱存在或 曾有烟粉虱发生，初步判定有烟粉虱传双生病毒病的发生。 3.5烟粉虱传烟草双生病毒病田间诊断 烟粉虱传烟草双生病毒病的田间症状：病株叶片卷曲、皱缩，叶脉深绿色、肿大，严 重时叶背产生叶耳，植株矮缩（参见资料性附录A图5）。若田间烟草表现上述类似症状， 且田间有一定数量的烟粉虱存在或曾有烟粉虱发生，初步判定有烟粉虱传双生病毒病的发 生。 4烟粉虱传双生病毒病实验室诊断 4.1主要仪器设备 高速台式冷冻离心机、植物组织匀浆器、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、超低温冰 箱、恒温水浴锅等。 4.2主要试剂 全国团体标准信息平台 T/GDPPS005-2022 3市售植物总DNA抽提试剂盒，普通PCR预混液，单链DNA滚环扩增试剂盒，2000bp DNA分子量标准，5000bpDNA分子量标准，BamHI、EcoRI、HindIII限制性内切酶， T4-DNA连接酶等。 4.3病样总DNA抽提 分别取病株、健康植物的叶片各100mg，按照植物总DNA提取试剂盒说明书抽提总 DNA，DNA沉淀溶解于50μL灭菌水中，直接使用或保存于-20℃冰箱备用。 4.4病毒PCR检测 4.4.1PCR扩增 利用检测烟粉虱传双生病毒的通用引物AV494（5′-GCCYATRTAYAGRAAGCCMA G-3′）和CoPR（5′-GANGSATGHGTRCADGCCATATA-3′）（Y=C/T、R=/G、M=A/C、 N=A/C/G/T、S=C/G、H=A/C/T）疑似病样总DNA进行PCR检测。反应体系为：植物总 DNA1.0μL（约20ng），灭菌水12.0μL，市售商品化的普通2×PCR预混液15.0μL，10μmol/L 引物AV4941.0μL，10μmol/L引物CoPR1.0μL，总体积为30.0μL。将上述反应混合液按 照以下步骤进行PCR扩增，94℃预变性4min；94℃变性45s，52℃退火45s，72℃ 延伸45s，35个循环完成后，72℃延伸10min结束反应，4℃保存。加5μLPCR产物在 1%琼脂糖凝胶板的加样孔中，毎板留一个加样孔加5μLDL2000DNA分子量标准，在电 压120V下进行电泳30min，最后在紫外凝胶成像系统观察结果。 4.4.2结果判定 选取室内接种烟粉虱传双生病毒的显症植株为阳性对照，当阳性对照能扩增出570bp 的特异性条带、健康对照和空白对照无扩增条带时，若待检样品能扩增出570bp条带，可 判定为阳性，也即该病样感染了烟粉虱传双生病毒；当待检样品无特异性扩增条带，判为 阴性，即该样品未感染烟粉虱传双生病毒（附录B）。 4.5病毒全基因组序列的获得 4.5.1滚环扩增Rollingcircleamplificationtechnique（RCA） 利用市售单链DNA滚环扩增试剂盒对5.4检测为阳性的代表性病样总DNA进行滚环 扩增，方法按照试剂盒说明书上的步骤进行。具体为：首先取1.0μL（约20ng）病样总DNA 加入灭菌的PCR管中，随后加入到5.0L样品缓冲液中，95℃变性3min，立即置冰上冷却， 加入5.0L反应缓冲液和0.2LDNA聚合酶，30℃恒温反应18h~20h，最后65℃加热10 min使酶失活终止反应，所获产物直接用于后续酶切鉴定，也可-20℃长期保存。 4.5.2滚环扩增产物酶切鉴定 全国团体标准信息平台 T/GDPPS005-2022 4上述所获滚环扩增产物分别用BamHI，EcoRI，HindIII等限制性内切酶进行酶切。若 滚环扩增产物被酶切出2.7~3.0kb条带（附录C），则推测其可能是病毒基因组A或B组分的 全长；若切出~1.4kb左右的条带（附录C），则推测其可能是伴随病毒的卫星分子全长。 进一步对酶切产物进行克隆、测序。 4.5.3PCR扩增 针对通用引物PCR检测阳性而RCA产物未切出的条带、田间症状典型的病样，进一步 根据570bp片段测序，设计一对背向特异引物来扩增DNA-A全长；利用扩增卫星分子全长 的通用引物扩增伴随的卫星分子全长。 4.6病毒种类确定 测定的序列经DNAStar软件SeqMan拼接后获得病毒全基因组序列，然后在GenBank数 据库（www.ncbi.nlm.nih.gov）中利用BLASTn程序进行序列相似性搜索，进一步用SDT1.2 的MUSCLE进行序列相似性比较分析，最后依据国际双生病毒分类标准来确定病毒种类。 目前双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色黄花叶病毒属（Begomovirus）病毒种的最新分 类标准为，所获病毒DNA-A序列与全部已知病毒相似性<91%时，判定为双生病毒新种； 与某一已知病毒相似性为91%~94%时，判定为该已知病毒的新株系；与某一已知病毒相似 性>94%时，判定为该已知病毒的分离物。 全国团体标准信息平台 T/GDPPS005-2022 5附录A （资料性附录） 烟粉虱传双生病毒病田间症状 图A.1烟粉虱传番茄双生病毒病 图A.2烟粉虱传黄秋葵双生病毒病 图A.3烟粉虱传南瓜双生病毒病 全国团体标准信息平台 T/GDPPS005-2022 6 图A.4烟粉虱传甘薯双生病毒病 图A.5烟粉虱传烟草双生病毒病 全国团体标准信息平台 T/GDPPS005-2022 7附录B （资料性附录） 烟粉虱传双生病毒PCR检测结果电泳图 图6疑似病样滚环扩增产