ICS07.100.99 CCSB41T/ZNZ 浙江省农产品质量安全学会团体标准 T/ZNZ098—2021 畜禽源和养殖环境中弗格森埃希菌的分离 及药敏试验方法 IsolationofEscherichiafergusoniifromlivestockandpoultrysources andbreedingenvironmentanditsantimicrobialsusceptibilitytesting 2021-12-24发布 2022-01-24实施 浙江省农产品质量安全学会发布 全国团体标准信息平台 T/ZNZ098—2021 I前  言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化标准的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。 本文件起草单位：浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所、佛山科学技术学院、浙江省动 物疫病预防控制中心、浙江大学医学院附属第一医院、金华金婺农业发展有限公司。 本文件主要起草人：唐标、马剑钢、杨华、林家辉、刘璨颖、关椿久、吴静、陈洁、周炜、汪建妹、 罗琦霞、冯伟峰、蒋春青、王小骊、吉小凤、肖英平、吕文涛、肖兴宁、汪雯、李锐。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ098—2021 II引言 弗格森埃希菌（Escherichiafergusonii），肠杆菌科埃希氏菌属，无芽孢、周身鞭毛的杆状革兰氏阴 性菌，兼性厌氧，不发酵乳糖、D-山梨醇，能利用D-木糖、阿拉伯糖、核糖醇、L-鼠李糖、海藻糖、 麦芽糖和纤维二糖，可引起腹泻等症状，是动物和人的条件致病菌。弗格森埃希菌作为大肠埃希菌的同 属菌，对抗生素同样存在多重耐药性，频繁的从动物和人类感染组织中被分离出来，且具有致病性。此 外，从前期研究和文献报道中发现，常规分离的大肠埃希菌存在一定比例被误判为弗格森埃希菌，从而 给细菌流行性和疾病诊断造成困扰。因此，加强对弗格森埃希菌的分离及药敏试验十分必要。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ098—2021 1畜禽源和养殖环境中弗格森埃希菌的分离及药敏试验方法 1范围 本文件规定了畜禽源和养殖环境中弗格森埃希菌的分离及药敏试验的术语和定义、设备和材料、试 剂、培养基与参考菌株、试验程序、样品处理、分离纯化、PCR鉴定、微量肉汤稀释法药敏试验及生物 安全的要求。 本文件适用于畜禽源（指源于畜禽的组织、内容物、排泄物、分泌物和肉制品等）和养殖环境中弗 格森埃希菌的分离及药敏试验。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB4789.1食品安全国家标准食品微生物学检验总则 GB4789.3食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数 GB4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验 GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 WS/T639抗菌药物敏感性试验的技术要求 T/ZNZ044畜禽养殖环节细菌耐药性监测方法 CLSIM100抗微生物药敏试验标准（PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting） 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 药敏试验antimicrobialsusceptibilitytesting 测定微生物（本文件特指细菌）在体外对抗微生物药物（本文件特指抗菌药物）的敏感性，以指导 临床合理选用药物的微生物学试验。 3.2 最低抑菌浓度minimalinhibitoryconcentration,MIC 采用肉汤稀释法等培养微生物进行药物敏感性检测试验中能抑制肉眼可见的微生物生长的最低抗 菌药物浓度。 3.3 全国团体标准信息平台 T/ZNZ098—2021 2折点breakpoint 能预测临床治疗效果，用以判断测试菌株敏感（Susceptible，S）、中介（Intermediate，I）和耐药 （Resistant，R）的最低抑菌浓度（MIC，μg/mL）的数值。 4设备和材料 4.1设备 用于细菌分离的微生物实验室应符合GB19489生物安全二级实验室（BSL-2）要求，灭菌、培养 和鉴定设备按GB4789.1执行，其他设备如下： ——生物安全柜； ——微量移液器：0.1μL～2.5μL、1μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL； ——自动加样仪或多通道微量加样器：10μL～100μL； ——电子天平：感量0.001g； ——麦氏比浊仪：可测量范围0.01～4.00麦氏单位； ——核酸电泳仪； ——凝胶成像系统； ——聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）扩增仪； ——恒温培养箱：36℃±1℃； ——低温贮藏箱； ——冰箱：2℃～8℃，-20℃，-80℃。 4.2材料 需要用到的相关实验材料如下： ——无菌培养皿：直径60mm或90mm； ——96孔透明无菌微孔板； ——1μL一次性无菌接种环、10μL一次性无菌接种环； ——一次性无菌采样拭子、无菌水样采集袋、无菌棉棒； ——标准比浊管； ——商品化药敏试验板； ——细菌DNA提取试剂盒； ——弗格森埃希菌特异性PCR扩增引物； ——PCR扩增试剂盒。 5试剂、培养基和参考菌株 5.1实验用水 培养基配制用水应符合GB4789.28的规定，试剂配制用水应符合GB/T6682的规定。 5.2试剂 5.2.1无菌生理盐水及其制备按GB4789.1执行。 5.2.2核糖醇（adonitol）母液及制备按附录A中A.1执行。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ098—2021 35.3培养基 5.3.1Carry-Blair转运培养基（Carry-BlairTransportMedium）及其制备按GB4789.28执行。 5.3.2LB（Luria-Bertani）琼脂平板及其制备按T/ZNZ044执行。 5.3.3缓冲蛋白胨水（BufferedPeptoneWater,BPW）及其制备按GB4789.4执行。 5.3.4西蒙氏枸橼酸盐琼脂（SimmonsCitrateAgar,SCA）平板其制备按附录A中表A.1执行。 5.3.5mFC琼脂平板及其制备按附录A中表A.2执行。 5.3.6MH肉汤（Mueller-Hintonbroth）及其制备按WS/T639执行。 5.4参考菌株 5.4.1质控菌株 大肠埃希菌（Escherichiacoli）标准菌株ATCC25922，保存、传代等要求应按照GB4789.28的要 求执行。 5.4.2阳性对照菌株 弗格森埃希菌（Escherichiafergusonii）标准菌株ATCC35469，保存、传代等要求应按照GB4789.28 的要求执行。 6试验程序 图1弗格森埃希菌分离及药敏试验程序 7样品处理 7.1样品采集 全国团体标准信息平台 T/ZNZ098—2021 47.1.1直肠/泄殖腔拭子采集 用无菌生理盐水浸润一次性无菌棉棒，伸入家畜直肠或家禽泄殖腔1.5cm～2.0cm，旋转2圈～3 圈，立即将棉拭子置于10mL转运培养基中。 7.1.2新鲜粪便采集 用一次性无菌棉棒蘸取新鲜粪便，不应沾有泥土或其他污染物，立即将棉拭子及样品置于10mL 转运培养基中。 7.1.3盲肠内容物采集 用一次性无菌棉棒蘸取盲肠内容物，立即置于10mL转运培养基中。 7.1.4畜禽肉及肉制品采集 采集屠宰场、批发市场、超市及农贸市场等的畜禽肉及肉制品，每个样品量不少于50g，置于无 菌采集袋中，密封冷藏。 7.1.5环境水样采集 用无菌水样采集袋收集50mL环境水样，包括畜禽舍冲洗用水、降温用水以及养殖场生活污水等， 密封后冷藏。 7.1.6环境样本采集 用无菌棉棒擦拭养殖环境中的笼子、料槽、水槽、围墙等各个物体的表面（>4cm2），收集环境表 面微生物，迅速置于含有BPW增菌液的密封袋中，冷藏。 7.2样品保存 样品采集后应密封置于2℃～8℃保存，且需要避免交叉污染，并加注样品标识，保留采样记录 和样品编码，应按照GB4789.1执行。 7.3样品运输 采集的样品按GB4789.1要求运达检验单位，运输时间不超过24h，运输工具应保持清洁，运输过 程中应防止包装破损导致样品渗漏。 7.4样品接收 样品运回实验室时，应确认样品完好情况，拭子样品可在2℃～8℃保存不超过5d后增菌，其 他样品应立即进行增菌。 8分离纯化 8.1增菌 拭子样品在5mLBPW增菌液中搅动数次；组织样本参照GB4789.3制备匀液，取0.5mL接种于5 mLBPW增菌液中；水样样本直接取0.5mL接种于5mLBPW增菌液中。接种后的增菌液在36℃± 1℃条件下180r/min培养12h～18h。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ098—2021 58.2筛选 8.2.1SCA琼脂平板培养 蘸取按8.1培养后的增菌液，划线接种于SCA琼脂平板，置于36℃±1℃条件下培养24h～36h。 菌落中心若有橙黄色沉淀，可判定为疑似弗格森埃希菌。 8.2.2mFC琼脂平板培养 将8.2.1所述疑似单菌落划线于mFC琼脂平板上，36℃±1℃条件下培养18h～24h。平板上呈透 明无色、灰色或淡红色的菌落