SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2497.23—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第23部分：细胞器的分离实验方法 Test method of import and export dangerous chemicals- Part 23:Separation of cellular organelles 行业标准信息服务平台 2010-03-02发布 2010-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2497.23—2010 前言 第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验； 第2部分：空斑形成细胞（PFC)试验； 第3部分：大型泽繁殖试验； 第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验； 第5部分：睾丸细胞UDS试验； 第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验； 第7部分：小鼠耳肿胀试验； 第8部分：窝淋巴结试验； 第9部分：血清溶血素测定试验； 第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验； 第11部分：种系突变试验； 第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验； 第13部分：荧光原位杂交试验； 第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验； 第15部分：PCR-SSCP实验； 第16部分：Western-Blot实验； 第17部分：哺乳动物行为毒理学试验； 第18部分：DNA加合物的检测方法； 第19部分：NorthernBlot实验； 第20部分：Bradford法测定蛋白质含量； 第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验； 第22部分：DNA的Tm值测定方法； 第23部分：细胞器的分离实验方法； 第24部分：细胞免疫功能体外检测方法； 隹信息服务平 第25部分：体液免疫功能试验， 第26部分：巨噬细胞功能试验； 第27部分：流式细胞术检测调亡； 第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用； 第29部分：生化需氧量（BOD）测定。 本部分为SN/T2497系列标准的第23部分。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检 疫局。 本部分主要起草人：吕刚、王利兵、冯智勐、李学洋、赵青、庞震 本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 1 SN/T2497.23—2010 进出口危险化学品安全试验方法 第23部分：细胞器的分离实验方法 1范围 SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品安全试验细胞器的分离实验方法中，试验样品、试 验溶液和试验步骤， 本部分适用于进出口危险化学品安全试验细胞器的分离实验方法。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本部分。 2. 1 线粒体mitochondrion 真核细胞内的双层膜细胞器，是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所。 2.2 微粒体microsomes 细胞被匀浆破碎时，内膜系统的膜结构破裂后自已重新封闭起来的小囊泡（主要是内质网和高尔基 体），这些小囊泡的直径大约100nm左右，是异质性的集合体。 2.3 内质网体endoplasmicreticulum 在细胞中由膜围成的隧道系统，是细胞中的重要细胞器。 3原理 细胞内不同结构的比重和大小都不相同，离心的沉降速度也不相同，根据这一原理，用差速离心法， 先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构， 如细胞核、线粒体等得以分离。 业标准信 4试剂 4.1生理盐水 4.2RSB溶液 Tris·CI的终浓度为10mM;MgCl的终浓度为3mM;KCI的终浓度为10mM。用稀盐酸调pH 值至7.4，高压灭菌后，4℃保存。 4.32×Buffer E 溶液中各组分含量为：D-山梨醇的终浓度为2M;HEPES的终浓度为10mM;EDTA的终浓度为 2mM。用稀NaOH溶液调pH值至7.4，膜过滤除菌，4℃保存。 5试验步骤 5.1细胞裂解 将细胞用RSB溶液重悬，按1：10的体积比加入3%的NP-40，反复混匀，冰浴10min。 5.2细胞核与线粒体的分离 在超速离心机上，将细胞裂解物以5000r/min离心20min，收集上清液； 1 SN/T2497.23—2010 在沉淀中加人等体积的2×BufferE，重悬后再次以5000r/min低速离心20min，收集上清液； 合并两次的上清液，并以13000r/min（12000Xg）离心1h，沉淀即为细胞核（Nuclear）与线粒体 （Mitochondrial），将其重悬于RSB中，分装后一80℃冻存。 5.3微粒体和内质网体的分离 将13000r/min离心所得的上清液再次以23000r/min（40000×g）离心1h，所得上清液为细胞 浆液，分装后一80℃冻存； 收集沉淀，此时沉淀为微粒体与内质网体，小心的用5mL1×BufferE洗涤沉淀，并以23000r/min (40000Xg）离心30min; 将离心所得沉淀重悬于2mL1×BufferE，用注射器针头反复抽吸沉淀，使其尽可能被破碎； 将破碎后的沉淀重悬液以37000r/min（100000×g）高速离心2h，上清液即为内质网体腔液，分 装后一80℃冻存；沉淀为内质网体腔膜，重悬于RSB中，分装后一80℃冻存。 行业标准信息服务平台