ICS_ 65. 120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 934—2005 饲料中地西的测定 高效液相色谱法 Determination of diazepam in feeds High-performance liquid chromatography 行业标准信息服务平台 2005-09-21 发布 2005-12-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 934—2005 前言 本标准在参照国内外有关饲料中地西泮的测定方法的基础上，提出用高效液相色谱法(HPLC法) 测定饲料中的地西泮。 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心（济南）、国家饲料质量监督检验中心(北京）。 本标准主要起草人：汤文利、李俊玲、李有志、徐强、李蔚、门晓冬、苏晓鸥。 行业标准信息服务平 I NY/T934—2005 饲料中地西的测定高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了用高效液相色谱仪测定饲料中地西泮的方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。最低检测浓度为1mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 3原理 在碱性条件下,用正已烷与二氯甲烷的混合溶液，将饲料中的地西泮经液液萃取提取出来，再经固 相提取、净化,直接在HPLC上分离、测定。 4试剂和材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 4.1水符合GB/T6682中一级水和三级水的规定。一般化学分析试验用三级水，高效液相色谱分析 和硅酸镁固相萃取小柱的淋洗用一级水。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3碳酸钠溶液:p(Na2COs）=100g/L。 4.4提取液：正已烷+二氯甲烷=7+3。 4.5乙酸铵溶液：c(CHsCOONH4）=25mmol/L，准确称取1.927g乙酸铵，用一级水(4.1)溶解、定容 至1000mL,过0.45μm的微孔滤膜。 4.6HPLC流动相：乙腈（色谱纯）+乙酸铵溶液（4.5）=45+55,用前超声脱气5min。 4.7地西泮标准贮备液(100μg/mL)：准确称取10.1mg地西洋标准品（≥99.0%）,用甲醇溶解、定容 至 100 mLc 4.8地西洋标准系列溶液：准确移取地西洋标准贮备液(4.7),用甲醇配制成标准系列溶液1.00μug/ mL.5.00 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 pg/mL.30.0 μg/mL、40.0 μg/mL、50.0 μg/mLo 4.9硅酸镁固相萃取小柱:200mg/3ml。液体的过柱速度为成滴滴下。 信息服务平 5仪器 5.1实验室用样品粉碎机。 5.2分析天平：感量0.1mg。 5.3离心机：4000r/mino 5.4超纯水器。 5.5超声波清洗器。 NY/T 934—2005 5.6旋涡混合器。 5.7带盖塑料离心管：100mL 5.8高效液相色谱仪：具有Ci8柱、紫外检测器和二极管阵列检测器。 6采样 6.1采样步骤：按GB/T14699.1的规定进行。 6.2试样的制备：选取具有代表性的实验室样品1000g，用四分法缩减分取200g左右，粉碎过0.45 mm孔径的筛,充分混匀，装人磨口瓶中备用。 7分析步骤 7.1提取 称取试料约2g(精确至0.1mg)于离心管(5.7)中，加人三级水(4.1)20mL，用碳酸钠溶液(4.3)调 pH 至 8~9。 准确加人提取液（4.4)15.00mL；加人提取液后，轻摇数秒；加盖密封，旋涡（5.6)混匀数秒，放气； 旋涡混匀30s两次；4000r/min（5.3)离心5min；吸取上清液于具塞试管中。再准确加人提取液 15.00mL，重复上述操作，合并两次上清液，旋涡混匀。 7.2净化 准确移取配合饲料试液（7.1)15.00mL、浓缩饲料试液（7.1)6.00mL、添加剂预混合饲料试液 (7.1)3.00mL,注人已用甲醇2mL(4.2)和提取液3mL处理过的硅酸镁固相萃取小柱（4.9),用一级 水3mL淋洗，再准确移取甲醇2.00mL洗脱，收集洗脱液。调整洗脱液的用量，使洗脱液中地西泮的 浓度在1.00μg/mL～50.0μg/mL之间。旋涡混匀,过0.45μm微孔滤膜,上HPLC测定。 7.3HPLC测定参数的设定 色谱柱：C8柱，柱长250mm,内径4.0mm,粒度5μm或性能类似的分析柱。 柱温：室温。 流动相：乙腈+乙酸铵溶液=45+55（4.6)。 流速:1.00 mL /min。 检测器：紫外检测器和二极管阵列检测器。 检测波长：254nm 进样量：20μL。 7.4定性定量方法 7.4.1定性方法 除用保留时间定性外,还必须用二极管阵列检测器测定地西洋紫外光区的特征光谱，即在201nm、 229nm、254nm、317nm处有四个依次变低的吸收峰。 7.4.2定量方法 用紫外检测器或二极管阵列检测器测定标准系列溶液(4.8)和试料溶液(7.2)中地西泮峰面积的响 应值,用多点校准法定量。 8结果计算 饲料中地西泮的含量X，以毫克每千克(mg/kg)表示，按公式(1)计算： (1) m× V3 式中： 2 NY/T 934-2005 A——试料溶液中地西泮峰面积的响应值对应的浓度,单位为微克每升(μg/mL)； Vi一一加入提取液的总体积,单位为毫升(mL); V2—甲醇洗脱液的总体积,单位为毫升(mL); 一试料的质量，单位为克(g); m- V3一一移取试液上硅酸镁固相萃取小柱的体积,mL。 每个试样取两份试料进行平行测定，以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，结果保留三位 有效数字。 重复性 9 在同一实验室，由同一操作人员完成的两个平行测定结果，相对偏差不大于10%。 行业标准信息服务平 3 NY/T 934-2005 A——试料溶液中地西泮峰面积的响应值对应的浓度,单位为微克每升(μg/mL)； Vi一一加入提取液的总体积,单位为毫升(mL); V2—甲醇洗脱液的总体积,单位为毫升(mL); 一试料的质量，单位为克(g); m- V3一一移取试液上硅酸镁固相萃取小柱的体积,mL。 每个试样取两份试料进行平行测定，以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，结果保留三位 有效数字。 重复性 9 在同一实验室，由同一操作人员完成的两个平行测定结果，相对偏差不大于10%。 行业标准信息服务平 3 NY/T 934-2005 A——试料溶液中地西泮峰面积的响应值对应的浓度,单位为微克每升(μg/mL)； Vi一一加入提取液的总体积,单位为毫升(mL); V2—甲醇洗脱液的总体积,单位为毫升(mL); 一试料的质量，单位为克(g); m- V3一一移取试液上硅酸镁固相萃取小柱的体积,mL。 每个试样取两份试料进行平行测定，以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，结果保留三位 有效数字。 重复性 9 在同一实验室，由同一操作人员完成的两个平行测定结果，相对偏差不大于10%。 行业标准信息服务平 3