ICS 67.060 X 11 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 33422018 花生中白藜芦醇及白藜芦醇异构体 含量的测定 超高效液相色谱法 Determination of resveratrol and resveratrol glycoside isomers in peanut- Ultra performance liquid chromatography method 行业标准信息服务平台 2018-12-19发布 2019-06-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3342—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部乡村产业发展司提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农产品加工研究所、山东金胜粮油集团、山东东升粮油有限公司。 本标准主要起草人：王强、石爱民、夏小勇、刘红芝、刘丽、胡晖、高冠勇、胡玉中。 行业标准信息服务平台 I NY/T3342—2018 花生中白藜芦醇及白藜芦醇苷异构体 含量的测定 超高效液相色谱法 1范围 本标准规定了测定花生中白藜芦醇及自蒙声 醇甘异构体（反式白藜芦醇、反式白藜芦醇苷、顺式白 本标准适用于花生仁 本标准方法反式白 黎芦醇 页式白蒙芦醇、顺式白藜芦 醇苷定量检出限为3 2 规范性引用文件 下列文件对 文化的应 用是必不可少的 凡是江百期的用文件 版本适用于本文 件。凡是不注日 其最新版公电据所有 引用文 GB 5491 验托样分样 粮 GB/T 6682 室用水规格和试 3术语和定义 下列术语和定 CE 3. 1 白藜芦醇及 异构体 resveratrol and resver atrolglycoside 反式白藜芦配 蒙芦醇 芝醇 ispiceiel resveratrol), 顺式白藜芦醇苷（c 4原理 试样中的白藜芦醇及白薯芦醇吉异构体川乙醇 水溶液提取，提取液离心 上清液定容，用配有 紫外检测器或二极管阵列检测器的超高效 活色谱仪进行测定以保留时间定 性，外标法定量。 5试剂和材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂，实验中所用水应GB/T6682中一级水的要求。 服务平台 5. 1 无水乙醇(C,HOH)。 5.2甲醇（CH,OH)：色谱纯。 5.3甲酸(HCOOH)：色谱纯。 5.480%乙醇溶液：取800mL无水乙醇（5.1），加200mL水，混匀 5.5液相流动相： A相：0.1%甲酸水溶液，取1mL甲酸（5.3），加999mL水，混匀并脱气。 B相：甲醇，取1L甲醇（5.2)脱气。 5.6 6反式白藜芦醇（CAS号：501-36-0）：纯度≥98%。 5.7 7反式白藜芦醇苷（CAS号：65914-17-2）：纯度≥98%。 NY/T 3342—2018 5.8标准储备溶液：分别准确称取反式白藜芦醇、反式白藜芦醇苷标准品6.25mg（精确至0.01mg）， 分别用甲醇（5.2）溶解并定容至250mL，得到25mg/L的单标储备液。顺式白藜芦醇和顺式白藜芦醇 苷储备液是由反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷标准溶液置于365nm紫外光下分别照射120min和60 min制得。 5.9混合标准工作液：准确移取0.1mL、1.0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL反式白藜芦醇、 反式白藜芦醇苷标准储备溶液（5.8），用甲醇（5.2）稀释并定容至50mL，得到一系列的标准工作溶液 （质量浓度分别为0.05mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、7.5mg/L、10.0mg/L）。取适量反式白 藜芦醇及反式白藜芦醇苷标准储备溶液（5.8），置于干燥洁净的培养皿中，于365nm紫外光下10cm处 分别照射2h和1h，反式白藜芦醇溶液分别于20min、40min、60min、80min、100min、120min时间点 取样，反式白藜芦醇苷溶液分别于10min、20min、30min、40min、50min、60min时间点取样，装人棕色 液相色谱进样瓶；随后准确量取0.5mL照射120min的反式白藜芦醇标准溶液及0.5mL照射60min 的反式白藜芦醇苷标准溶液，按1：1比例混合均匀，制得混合标准工作液，装人棕色液相色谱进样瓶 中，于一18℃下避光保存，保存有效期为1个月。 6仪器和设备 6.1超高效液相色谱仪：带紫外检测器或二极管阵列检测器。 6.2紫外分析仪：波长365nm。 6.3冻干机：隔板温度一20℃、真空度13Pa～200Pa，凝冰温度-52℃，或性能相当者。 6.4粉碎机：高速万能粉碎机，转速24000r/min，或相当的设备。 6.5匀浆机：不低于5000r/min，或相当的设备。 6.6离心机：不低于5000r/min，或相当的设备。 6.7涡旋振荡器：0r/min~3300r/min。 6.8天平：感量0.01mg、0.01g。 6.9滤膜：孔径0.22μm、直径25mm的聚砜膜或相当者。 7操作步骤 7.1试样制备与保存 花生果样品脱壳，花生仁、花生红衣样品直接取样，花生芽需预先冻干处理。 分取花生仁约100g，用粉碎机（6.4）粉碎2min3min；取花生红衣、冻干处理后的花生芽约100 g，用粉碎机（6.4)粉碎2min~3min，过250μm筛。如需保存，应于一18℃保存。 7.2提取 准备称取5g（精确至0.01g）样品于100mL离心管中加人60mL80%乙醇溶液（5.4)，在匀浆机 中匀浆提取2min后，于5000r/min离心10min，将上清液转入100mL棕色容量瓶中，样品残渣再分 别用10mL80%乙醇溶液（5.4）提取2次，合并3次提取液，用80%乙醇溶液（5.4）定容至100mL，摇匀 后过0.22μm滤膜，置入棕色液相色谱进样瓶中，待测。 7.3测定 7.3.1超高效液相色谱参考条件 色谱参考条件如下： a) 色谱柱：Cs，2.1mm×100mm，1.8μm，或性能相当者； b）流动相：A相为0.1%甲酸水溶液（5.5）,B相为甲醇（5.5），梯度洗脱条件见表1； 流速：0.45mL/min； 2 NY/T 3342—2018 d）检测波长：285nm、306nm； 柱温：35℃； e) 进样量：1μL。 表1梯度洗脱条件 流动相，% 时间，min A相 B相 0 90 10 0.5 90 10 2.0 75 25 3.5 70 30 4.0 65 35 5.0 50 50 7.0 10 90 7.2 90 10 10.0 90 10 7.3.2标准曲线 （5.8），参考上述色谱条件（7.3.1)进行测定，以标准溶液的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制反式白 藜芦醇和反式白藜芦醇苷的标准曲线。 顺式白藜芦醇和顺式白藜芦醇苷的标准曲线绘制：取适量反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷标准储 备溶液，置于干燥洁净的培养皿中，于365nm紫外光下10cm处分别照射120min和60min，反式白藜 别于10min、20min、30min、40min、50min、60min时间点取样，进行超高效液相色谱分析，测定反式白 藜芦醇及反式白藜芦醇苷峰面积，由反式白藜芦醇和反式白藜芦醇苷的标准曲线求出反式体的浓度，再 由反式体浓度的减少求出溶液中顺式体的浓度，以顺式白藜芦醇及顺式白藜芦醇苷浓度为横坐标、峰面 积为纵坐标，以此建立顺式白藜芦醇和顺式白藜芦醇苷的标准曲线。 7.3.3色谱分析 分别将混合标准工作液和试样溶液进样，以保留时间定性，以样品溶液白藜芦醇各异构体峰面积与 标准溶液峰面积比较定量。标准样品色谱图参见附录B。 8结果计算 样品中白藜芦醇及白藜芦醇苷异构体的含量按式(1)计算 CXAXV X, = (1) A,Xm 式中： 样品中白藜芦醇或白藜芦醇苷异构体的质量分数，i=1,2,3，4，X为反式白藜芦醇、X2为 反式白藜芦醇苷、X3为顺式白藜芦醇、X4为顺式白藜芦醇苷，单位为毫克每千克（mg/ kg); 标准溶液中白藜芦醇或白藜芦醇苷异构体的浓度，单位为毫克每升（mg/L）； A 样液中白藜芦醇或白藜芦醇苷异构体的峰面积数值； V 试样最终定容体积，单位为毫升（mL）； A, 标准溶液中白藜芦醇或白藜芦醇苷异构体的峰面积数值； 3 NY/T3342—2018 样品质量，单位为克（g）。 测定结果取3次测定的算术平均值，计算结果保留至小数点后3位。 在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对数值不得超过算术平均值的10%。 U 息服务平台 NY/T3342—2018 附录A 资料性附录） 白藜芦醇及白藜芦醇苷异构体分子式与结构式 白藜芦醇及白藜芦醇苷异构体分子式与结构式见图A.1。 HO HQ OH HO HO 反式白藜芦醇（CuHz20,） 顺式白藜芦醇(CuHiz0,) HO HO HO HO HOW OH MOH _OH HO- 反式白藜芦醇苷（CHzOs) 顺式白藜芦醇苷(CuH.O,) 图A.1 白藜芦醇及白藜芦醇苷异构体分子式与结构式 行业标准信息服务平台 5