ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3320—2018 饲料中苏丹红等8种脂溶性色素的测定 液相色谱一串联质谱法 Determination of eight fat-soluble colorants including Sudan red in feeds- Liguid chromatography-tandem mass spectrometry 行业标准信息服务平台 2018-12-19发布 2019-06-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3320—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）归口。 本标准起草单位：农业农村部农产品质量安全监督检验测试中心（宁波）、台州学院。 本标准主要起草人：杨挺、朱勇、陈国、吴银良、赵健、付岩、张艳、蒋明、吕燕、章豪、张亮、王全胜。 行业标准信息服务平台 I NY/T3320—2018 饲料中苏丹红等8种脂溶性色素的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了饲料中苏丹红I、苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ、苏丹红IV、对位红苏丹红7B、苏丹红G和苏 PUBLI 丹黄的液相色谱-串联质谱测定方法 本标准的方法检测限为5 2规范性引用文件 本文件的应用 是注有期的小用文件， 下列文件对于 必不可少的 ESEARCH 用必件 其最新版不包括所有的修改单适本文 件。凡是不注日期的弓 析实验 GB/T 6682 用水规格和式验方法 分 何料 GB/T14699. 采样 动物饲 试样的制备 GB/T20195 3原理 试样中的脂溶性 化后液相色谱 质谱法测定，内标法 ICUL 定量。 4试剂或材料 分析纯的试剂和符合GB/T 定的 除非另有说明 用确认 6682 苏丹红G、苏丹 4.1脂溶性色素对照 果红N对位 黄的纯度均大于95% 4.2氛代脂溶性色素对照品 苏丹红 6、苏丹红 D、苏丹红G-D3、 手红 苏丹黄-Ds的纯度均大于95 4.3乙腈：色谱纯。 4.4甲酸：色谱纯。 4.50.2%甲酸溶液：准确移取2mL甲酸（4.4),用水稀释全1L。 4.60.2%甲酸溶液-乙腈溶液：0.2%甲酸溶液+乙=15+85。 4.7脂溶性色素和氛代脂溶性色素标准储备液：准确称取适量脂溶性色素对照品苏丹红I、苏丹红Ⅱ、 苏丹红Ⅲ、苏丹红IV、对位红、苏丹红7B、苏丹红G、苏丹黄及氛代脂溶性色素对照品苏丹红I-Ds、苏丹 红II-Ds、苏丹红II-Ds、苏丹红IV-D、苏丹红G-D3、苏丹黄-Ds，精准至0.00001g,分别置于100mL 棕色容量瓶中，用乙睛（4.3）超声使之完全溶解，并定容至刻度，使最终浓度均为100ug/mL，摇匀， 一18℃保存，有效期6个月。 4.8脂溶性色素标准中间液：分别准确移取苏丹红I、苏丹红ⅡI、苏丹红Ⅲ、苏丹红IV、对位红、苏丹红 7B、苏丹红G、苏丹黄标准储备液（4.7)各5.0mL，置于50mL棕色容量瓶中，用乙腈（4.3）定容至刻度。 该溶液中各脂溶性色素浓度为10μg/mL，一18℃保存，有效期6个月。 1 NY/T3320—2018 4.9氛代脂溶性色素标准中间液：分别准确移取苏丹红I-Ds、苏丹红II-Ds、苏丹红Ⅲ-D、苏丹红IV- Ds、苏丹红G-D3、苏丹黄-D，标准储备液（4.7)各5mL，置于50mL棕色容量瓶中，用乙腈（4.3）定容 至刻度。该溶液中各脂溶性色素浓度为10μg/mL，一18℃保存，有效期6个月。 4.10氛代脂溶性色素标准工作液：准确移取氛代脂溶性色素标准中间液（4.9)0.5mL于50mL棕色 容量瓶中，用0.2%甲酸溶液-乙腈溶液（4.6)定容至刻度。该溶液中各脂溶性色素浓度为100μg/L，临 用现配。 4.11脂溶性色素标准工作液：准确移取标准中间液（4.8）、氛代脂溶性色素标准工作液（4.10）适 量，用0.2%甲酸溶液-乙腈溶液（4.6）稀释成浓度为1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、20μg/L、50μg L和200μg/L的系列标准工作溶液，每一标准工作溶液含各氛代脂溶性色素浓度均为20μug/L，临用 现配。 4.12N-丙基乙二胺(PSA):粒径40 μm～60μm。 5仪器设备 5.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。 5.2离心机：最大转速5000r/min或以上。 5.3分析天平：感量0.01mg。 5.4天平：感量0.01g。 5.5振荡器。 5.6涡旋振荡器。 5.7塑料离心管：10mL,50mL。 6样品 按照GB/T14699.1抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减至500g，按照GB/T20195制备样 品，粉碎后过0.45mm孔径的分析筛，混匀后装人密闭容器。 7试验步骤 7.1提取 称取试样5g（精确至0.01g），置于50mL塑料离心管中，准确加人氛代脂溶性色素标准中间液 （4.9)62.5μL，涡旋混合15s后准确加人25mL的乙睛（4.3），于振荡器（5.5）上振荡提取30min，5000 7.2净化 准确吸取7.1得到的试液2mL移人含50mgPSA的带盖10mL塑料离心管中，盖上盖子，涡旋 30s后，以5000r/min离心3min，取0.80mL上清液与0.20mL0.2%甲酸溶液（4.5）混合，过0.22μm 有机滤膜后供上机测定。 7.3测定 7.3.1色谱参考条件 色谱柱：C1s柱，柱长100mm，内径2.1mm，粒径1.7μm；或性能相当者。 流速：0.3mL/min。 进样量：10μL。 柱温：35℃。梯度洗脱程序见表1。 2 NY/T3320—2018 表1 梯度洗脱程序 时间，min 0.2%甲酸溶液，% 乙睛，% 15 85 0 0.5 15 85 2.5 5 95 4. 0 5 95 4. 1 15 85 5.0 15 85 7.3.2质谱参考条件 离子源：电喷雾离子源。 扫描方式：正离子扫描。 检测方式：多反应监测（MRM)。 脱溶剂气、锥孔气均为高纯氮气；碰撞气为高纯氩气或其他合适气体。使用前，应调节各气体流量， 以使质谱灵敏度达到检测要求。 毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等电压优化至最佳灵敏度。 定性离子对、定量离子对、保留时间、锥孔电压和碰撞能量参考值见表2。 表2脂溶性色素和内标物定性离子对、定量离子对、保留时间、锥孔电压和碰撞能量参考值 保留时间 定性离子对 定量离子对 锥孔电压 碰撞能量 中文名称 min m/z m/z V ev 249.0>92.9 28 苏丹红I 1.73 249.0>92.9 24 249.0>156.0 26 277.0>120.9 26 苏丹红IⅡ 2.46 277.0>156.0 22 277.0>156.0 22 352.7>76.9 36 苏丹红Ⅲ 2.91 352.7>76.9 26 352.7>120.0 36 381.0>91.0 38 苏丹红IV 3.92 381.0>91.0 42 381.0>224.5 34 226.0>76.9 30 苏丹黄 1.49 226.0>120.9 14 226.0>120.9 28 294.0>127.9 46 对位红 1. 36 294.0>156.0 26 294.0>155.9 22 279.0>156.0 26 苏丹红G 1.62 279.0>156.0 20 279.0>247.9 18 379.9>169.0 46 苏丹红7B 3.73 379.9>169.0 25 379.9>183.0 26 苏丹红I-D 1. 73 254.0>97.9 254.0>97.9 22 30 苏丹红Ⅱ-Ds 2.46 283.0>162.0 283.0>162.0 22 22 苏丹红IⅢI-Ds 2. 91 359.0>76.9 359.0>76.9 24 36 苏丹红IV-D 3.92 387.0>91.0 387.0>91.0 40 88 苏丹黄-D. 1.49 231.0>120.9 231.0>120.9 12 28 苏丹红G-D 1. 62 282.0>156.0 282.0>156.0 20 26 7. 3. 3 定性测定 在相同试验条件下，试样中待测物质的保留时间与标准溶液中待测物质对应的保留时间偏差在士 2.5%之内，且试样中各组分的2个子离子相对丰度与浓度接近的标准溶液的相应离子相对丰度一致， 偏差不超过表3规定的范围，则可判定为试样中存在对应的待测物。 3 NY/T3320—2018 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 单位为百分率 >50 20~50（含） 相对离子丰度 10~20（含） ≤10 允许的最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 7.3.4定量测定 在仪器最佳工作条件下，混合标准工作液与试样交替进样，采用内标法定量，其中苏丹红I、苏丹红 Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红IV、苏丹黄和苏丹红G选择相应同位素内标物进行定量，对位红选择苏丹红G-D3 进行定量，苏丹红7B选择苏丹红IV-D进行定量。 式样溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性 范围内，当样品的上机液浓度超过线性范围时，根测定浓度，稀释后进行重新测定。上述色谱和质 的图 HING 8试验数据处理 试样中脂溶性色素的含量 质量分数表示，单位为微 克每 .按式（1）或式（2）计算。 X1000 单点校准： (1) S 1000 式中： C. 武样落液中相应的脂济性色素内标浓度单位为微克每升 标准溶液中相应的脂深性色素浓度单化为微