ICS 65.120 B 25 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3310—2018 苏丹草和高丹草品种真实性鉴别 SSR标记法 Identification for variety genuineness of sudangrass and the hybrid of sorghum and sudangrassSSR marker method 行业标准信息服务平台 2019-06-01实施 2018-12-19发布 发布 NY/T3310—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口。 本标准起草单位：全国畜牧总站、农业农村部全国草业产品质量监督检验测试中心、青岛农业大学 北京市农林科学院、新疆农业大学。 本标准主要起草人：冯葆昌、高秋、马金星、孙娟、庞斌双、王凤格、张博、李存福、李玉荣、齐晓、刘芳、 张义、闫敏、屠德鹏、何珊珊、王梅娟。 行业标准信息服务平台 1 NY/T 3310—2018 苏丹草和高丹草品种真实性鉴别 SSR标记法 1范围 本标准规定了利用SSR（SimpleSequenceRepeat，简单重复序列）标记，进行苏丹草[Sorghumsu danense（Piper)Stapf.cv.J及其杂交种高丹草（SorghumbicolorXSorghum sudanense）品种真实性鉴别 的方法及判定规则。 本标准适用于苏丹草及其杂交种高丹草品种真实性鉴 2规范性引用文件 RD 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 件，其最新版 件。凡是不注日期的弓 川文 行 括所有的修改单 GB/T 2930.1 牧草 种子检验规程 样 GB/T 2930. 发茅试验 GB/T 6682 新实验室用水规格利代验方法 3原理 种的基因组中，存在者稳定遗传的SSR标 通过 样品与对照品 种SSR标记扩增产 小差异（位点差异判定送检样品的真实性 4试剂与材料 除另有规定外 分析 为分析纯的试 4.1水：符合GB 6683 C 4.2异丙醇(CH 4.3无水乙醇（Cz 4.4四甲基乙二胺（C 4.5去离子甲酰胺（CH 4. 6 TagDNA聚合酶。 4.7 剥离硅烷。 4.8矿物油。 4.9DNA分析仪用分子量内标。 4.10荧光素。 4.1110XPCR缓冲液（含Mg2+）。 4.120.5mol/LEDTA(pH8.0)溶液：称取18.61g二水合乙二胺四乙酸二钠（NazEDTA·2H2O)溶 于80mL水中，用固体氢氧化钠（NaOH)将pH调至8.0，加水定容至100mL，高压灭菌。 4.130.5mol/L盐酸溶液：取25mL浓盐酸（HCl），加水定容至500mL。 4.141mol/LTris-HCI溶液（pH8.0)：称取12.11g三羟甲基氨基甲烷[NH,C(CH2OH)3］溶于适量 水中，加0.5mol/L盐酸溶液（4.13)调pH至8.0，加水定容至100mL，高压灭菌。 4.15 5CTAB提取液：称取81.70g氯化钠(NaCI)和20.00g十六烷基三甲基溴化铵[C6H33（CH）：NBr溶于 1 NY/T3310—2018 水中，加人100mL1mol/ LTris-HCI溶液（4.14),40mL 0.5mol/ L的EDTA溶液（4.12),加水定容至 1000mL,常温储存。 4.16氯仿+异戊醇混合液：将氯仿(CHCl3)和异戊醇(C,Hi2O)按24+1的体积比例混合配制。 4.1770%的乙醇溶液：取350mL无水乙醇（CzH.O）加水定容至500mL。 4.18TE缓冲液(pH8.0)：取1mL0.5mol/LEDTA溶液(4.12)、5mL1mol/L的Tris-HCl(4.14) 溶液，加盐酸调pH至8.0，加水定容至500mL，高压灭菌。 4.19dNTPs溶液：用超纯水分别配制dATP、dGTP、dCTP、dTTP终浓度100mmol/L的储存液。各 取20μL混合，用超纯水720μL定容至终浓度2.5mmol/L的工作液，高压灭菌，一20℃保存。 4.20SSR引物溶液：用超纯水分别配制正向引物和反向引物浓度为10μmol/L的工作液。 4.21亲和硅烷缓冲液：取9.75mL无水乙醇（CsH12O)和250μL冰醋酸（C,H,O2)，用去离子水定容 至50mL 4.22亲和硅烷工作液：将5μL亲和硅烷原液和1mL亲和硅烷缓冲液（4.21)混合。 （HBO）溶于水中，加人37mL0.5mol/LEDTA溶液（4.12）用蒸馏水定容至1000mL，高压灭菌。 4.241×TBE缓冲液：取500mL10XTBE缓冲液（4.23），用去离子水定容至5000mL。 4.2540%丙烯酰胺溶液：称取190.00g丙烯酰胺（CHNO)和10.00g甲叉双丙烯酰胺[（H2C= CHCONH)2CHz]，溶于400mL去离子水中，定容至500mL。 4.266%变性聚丙烯酰胺溶液：称取420.00g尿素[CO（NH²）2］溶于水中，加人100mL10×TBE缓 冲液（4.23）和150mL40%丙烯酰胺溶液（4.25），过滤后加水定容至1000mL。 4.2710%过硫酸铵溶液：称取10.00g过硫酸铵[（NH,）2S2O:溶于100mL水中，分装后保存于 一20℃冰箱中备用。 4.286X上样缓冲液：量取98mL去离子甲酰胺（CH3NO)，加人2mL0.5mol/L的EDTA溶液 （4.12）、0.25g溴酚蓝（C2H24Br2OsS）、0.25g二甲苯青（C25H27NzO.S2Na），摇匀，放人4℃冰箱中 备用。 4.29固定液：量取100mL冰醋酸（CzH,Oz），加人1000mL去离子水。 4.30染色液：称取2.00g硝酸银（AgNO;），溶于1000mL去离子水中。 4.31显影液：称取15.00g氢氧化钠（NaOH)，溶于1000mL的蒸馏水中。使用之前加人6mL的甲 醛(CH,O)。 5仪器设备 5.1PCR仪。 5.2DNA分析仪。 5.3高压电泳仪。 5.4紫外分光光度计。 5.5电子天平：感量分别为0.01g和0.001g。 5.6高速冷冻离心机：转速为8000r/min~16000r/min，温度为一4℃~30℃。 5.7单道移液器（10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、1000μL。 6引物信息 用于苏丹草和高丹草品种真实性鉴别的SSR引物有20对，引物相关信息见附录A。 2 NY/T 3310—2018 7取样 7.1种子 种子样品的扦样、分样和保存，按GB/T2930.1的规定进行，抽取种子的重量不低于250g。 7.2植物组织 样品为生长在大田的植株组织时，可由扦样员到田间取样。取样的地块由委托检验的单位、组织或 个人指定。采用棋盘式取样法，扦取20个单株的植物组织，单独保存于冷藏盒（2℃～10℃）、硅胶干燥 器或液氮中。 8分析步骤 8.1试样制备 a）样品为种子时，应先发芽，种子发芽按GB/T2930.4的规定进行。 b) 随机选取至少20个个体的等量组织组成混合样品。 c）当样品出现可见的异质性且影响到差异位点判定时，重新对20个个体单独制样。 8.2DNA提取 试样加液氮充分研磨后，称取100mg~200mg粉末至2.0mL离心管，每管加人700μL65℃预热 的CTAB提取液（4.15），混匀。65℃水浴30min～60min，其间颠倒混匀2次～3次。于通风柜内加人 700μL氯仿十异戊醇混合液（4.16），颠倒混匀5min~10min。12000g（室温）离心10min，将上清液转 至新的2.0mL离心管。在上清液中加人一20℃预冷的等体积异丙醇（4.2）或2倍体积的无水乙醇 （4.3），轻轻混匀，置于一20℃冰箱30min以上。12000r/min（4℃）离心10min，弃去上清液。70%乙 醇溶液（4.17）洗沉淀2次，将离心管倒立于垫有滤纸的试验台上，室温干燥至无乙醇气味。加人TE缓 冲液（4.18)溶解沉淀，一20℃保存。用紫外分光光度计检测DNA浓度和质量（OD260/OD280在1.7～ 1.9），吸取部分原液稀释成20ng/uL的工作液，4℃保存。 注：其他所获DNA质量能够满足PCR扩增需要的DNA提取方法均适用于本标准。 8.3PCR扩增 8.3.1反应体系 在PCR反应管中按表1依次加人反应试剂，涡旋振荡混匀，反应液上覆盖10uL矿物油（4.8)（有 热盖功能的PCR仪可不加）。 表1PCR反应体系 试剂 终浓度 体积 10XPCR缓冲液（含Mg2+）（4.11） 11X 2.5μL dNTPs(4.19) 各0.2mmol/ L 2.0L 正向引物（4.20） 0.8μmol/L 2.0μL 反向引物（4.20） 0. 8 μmol/ L 2.0μL TaqDNA聚合酶（4.6) 0. 04 U/μL DNA溶液 2.0ng/μL 2.5 μL 水(4.1) 总体积 25.0ml 注1：用荧光标记检测技术时，正向引物需用荧光素（4.9)标记。 注2：一表示体积不确定，根据TagDNA聚合酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0μL。 8.3.2反应程序 94℃预变性5min；94℃变性40s,56℃退火35s72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃ 3 NY/T3310—2018 保存。 8.4PCR产物检测 8.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测 8