(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210226796.7 (22)申请日 2022.03.09 (71)申请人 上海辉文生物技 术股份有限公司 地址 201318 上海市浦东 新区紫萍路879号 (72)发明人 骆峰　赖志华　杨升平　董婷婷　 白雪冬　 (74)专利代理 机构 上海弼兴律师事务所 31283 专利代理师 黄益澍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种引物组合及利用其鉴定硫酸软骨素生 物来源的方法 (57)摘要 本发明公开了一种引物组合及利用其鉴定 硫酸软骨素生物来源的方法。 所述引物组合包括 至少一引物对， 所述引物对包括上游引物和下游 引物， 其中所述上游引物选自如SEQ  ID NO:1、 SEQ ID NO:3、 SEQ  ID NO:5、 SEQID  NO:7、 SEQ  ID  NO:9所示的核苷酸序列中的一种或多种； 所述下 游引物选自如SEQ  ID NO:2、 SEQ  ID NO:4、 SEQ   ID NO:6、 SEQ  ID NO:8、 SEQID  NO:10所示的核苷 酸序列中的一种或多种。 本发明还公开了包含所 述引物组合的试剂盒， 以及所述引物组合、 试剂 盒在鉴定硫酸软骨素生物来源中的应用。 本发明 能较好地对市场上鲨鱼、 鸡、 猪、 牛来源的硫酸软 骨素进行鉴别， 尤其是对DNA含量过低或破坏严 重的硫酸软骨素样品进行生物来源鉴定 。 权利要求书1页 说明书12页 序列表8页 附图3页 CN 114438229 A 2022.05.06 CN 114438229 A 1.一种引物组合， 其特征在于， 所述引物组合包括至少一引物对， 所述引物对包括上游 引物和下游引物， 其中所述上游引物选自如SEQ  ID NO:1、 SEQ  ID NO:3、 SEQ  ID NO:5、 SEQ   ID NO:7、 SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列中的一种或多种； 所述下游引物选自如SEQ  ID NO:2、 SEQ  ID NO:4、 SEQ  ID NO:6、 SEQ  ID NO:8、 SEQ  ID  NO:10所示的核苷酸序列中的一种或多种。 2.如权利要求1所述的引物组合， 其特征在于， 所述引物 组合包含以下一对或多对引物 对： 上游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:1， 下游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:2； 和/或， 上游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:3， 下游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:4； 和/或， 上游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:5， 下游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:6； 和/或， 上游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:7， 下游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:8； 和/或， 上游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:9， 下游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:10。 3.如权利要求2所述的引物组合， 其特 征在于， 所述引物组合由以下引物对组成： 上游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:1， 下游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:2； 上游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:3， 下游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:4； 上游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:5， 下游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:6； 上游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:7， 下游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:8； 和， 上游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:9， 下游引物的核苷酸 为SEQ ID NO:10。 4.一种鉴定硫酸软骨素生物来源的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包含如权利要求1 ～3任一项所述的引物组合。 5.如权利 要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包含DNA聚合酶、 PCR缓冲液、 dNTPs和/或去离 子水。 6.如权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述DNA聚合酶为Taq  DNA聚合酶， 和/或， 所述试剂盒还 包含镁离子。 7.一种鉴定硫酸软骨素生物来源的方法， 其特 征在于， 所述方法包 含以下步骤： 步骤(1)： 从含 硫酸软骨素的样品中提取获得分离的DNA； 步骤(2)： 以所述DNA为模板， 使用如权利 要求1～3任一项所述的引物组合或权利要求4 ～6任一项所述试剂盒进行 特异性PCR扩增； 步骤(3)： 对步骤(2)中获得的PCR扩增产物进行分离、 克隆、 测序和比对分析， 获得所述 样品中硫酸软骨素生物来源的信息 。 8.如权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(3)中的克隆为利用TA克隆的方法 克隆所述 步骤(2)中获得的PCR扩增产物。 9.如权利 要求7或8所述的方法， 其特征在于， 在所述步骤(1)之后， 还包括以下步骤： 以 步骤(1)中所述分离的DNA为模板， 利用PEP ‑PCR进行全基因 组扩增， 获得扩增的DNA。 10.如权利要求1～3任一项所述的引物组合、 如权利要求4～6任一项所述的试剂盒在 鉴定硫酸软骨素生物来源中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438229 A 2一种引物组合及利用其鉴定硫酸软骨素生物来源的方 法 技术领域 [0001]本发明属于质量检测领域， 具体涉及一种引物组合及利用其鉴定硫酸软骨素生物 来源的方法。 背景技术 [0002]硫酸软骨素(Chondroitin  Sulfate， CS)是来自于鸡胸骨， 猪软骨、 喉骨， 牛羊鼻 骨、 喉骨、 软肋、 气管、 月牙骨、 杂软骨， 鲨鱼软骨、 牙尖骨等富软骨组织的一类重要酸性高分 子粘多糖。 其主链是D ‑葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖交替连接的双糖聚合物。 [0003]不同来源的硫酸软骨素具有不同的作用。 据报道海参硫酸软骨素对大鼠酒精性胃 溃疡具有保护作用， 对小鼠肿瘤生长和 转移有抑制作用； 从黄鳝提取 的硫酸软骨素具有降 血脂和降血糖的功效； 鲨鱼硫酸软骨素具有抗炎、 抗病毒和抗动脉硬化的功效。 同时， 不同 来源的硫酸软骨素在市场价格上也有很大 的差异， 其中以鲨鱼硫酸软骨素最为昂贵。 因此 对市场上的硫酸软骨素进行准确鉴定有着重要的意 义。 [0004]目前硫酸软骨素鉴定方法主要有红外光谱法、 液相分析法和PCR法。 其中红外光谱 法通过分析样本中是否存在6 ‑硫酸基团或4 ‑硫酸基团来进 行判别； 液相分析法是通过对硫 酸软骨素进行酶解， 然后分析酶解片段 的相对峰面积。 由于不同厂家的硫酸软骨素制备方 式各有不同， 同时相同来源的生物大分子也存在不均一性。 这两种方法准确度不高， 重复性 较差， 只能用于 辅助分析。 [0005]PCR法是鉴定生物样品来源最准确的方法。 GBT21101 ‑2007(猪)、 GBT21104 ‑2007 (牛)、 SNT2978 ‑2011(鸡)、 SNT3647 ‑2013(鲨鱼)对硫酸软骨素的物种来源分析都采用PCR 法。 [0006]这些标准文件主要包括三个步骤： (1)从样品中提取D NA； (2)分别设计属于鸡猪牛 羊的特异性引物进行扩增； (3)通过测序确认样品的生物来源。 [0007]但这种方法有三个主 要问题： [0008]①没有考虑到样品中的DNA含量过少导 致无法实现扩增。 [0009]②没有考虑到样品中的DNA严重破碎， 可能有大量缺失以至于设计 的特异性引物 对应的DNA片段 可能根本不存在。 [0010]③没有考虑到样品掺假的情况。 比如有的标准文件规定从样品中检测到鲨鱼序列 则判定为鲨鱼来源， 没有考虑到其他来源的硫酸软骨素和鲨鱼硫酸软骨素混合掺假的情 况。 [0011]现有技术缺乏一种能够准确鉴定硫酸软骨素生物来源的方法。 发明内容 [0012]为了克服现有技术中利用PCR扩增特异性片段鉴别硫酸软骨素生物来源中常会遇 到样本中DNA含量极低且破坏严重的情况， 以至于目标片段不存在而造成假阴性结果的技 术问题， 本发明旨在提供一种利用PEP扩增技 术鉴定硫酸软骨素生物来源的方法。说　明　书 1/12 页 3 CN 114438229 A 3