(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210252596.9 (22)申请日 2022.03.09 (71)申请人 重庆医科 大学 地址 400010 重庆市渝中区石油路街道医 学院路1号 (72)发明人 刘秋云　望芳鸣　黎刚　 (74)专利代理 机构 重庆信必达知识产权代理有 限公司 5 0286 专利代理师 陈小东 (51)Int.Cl. G01N 33/574(2006.01) C12Q 1/682(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于滚环扩增反应检测肿瘤细胞的方 法 (57)摘要 本发明公开了一种基于滚环扩增反应检测 肿瘤细胞的方法， 属于生化检测和分子诊断领 域， 其技术方案要点是， 步骤如下： S1、 选出特异 性结合MUC1的适配体S2.2， 并设计与适配体S2.2 部分互补的核酸链CDNA； S2、 使适配体S2.2和 CDNA形成双链 Ⅰ； S3、 获得MCF ‑7细胞样品； S4、 向 MCF‑7细胞样品中加入双 链Ⅰ、 锁式探针、 T 4DNA连 接酶缓冲液和T 4DNA连接酶， 反应完成后灭活酶， 获得反应产物 Ⅱ； S5、 向反应产物 Ⅱ加入Phi  29DNA聚合酶、 dNTPs、 BSA和Phi  29DNA聚合酶缓 冲液， 反应结束后得到串联重复的G四链 体单链； S6、 在产物 Ⅲ中加入荧光染料Tb3+。 本发明主要 用于将靶细胞的数量信号转化为滚环扩增反应 扩增出的大量串联重复G四链体敏化的Tb3+信 号， 本方法灵敏度高。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 114509568 A 2022.05.17 CN 114509568 A 1.一种基于滚环扩增反应 检测肿瘤 细胞的方法， 其特 征是， 步骤如下： S1、 筛选出特异性结合MUC1的适配体S2.2， 并设计与所述适配体S2.2部分互补的核酸 链CDNA； S2、 向所述适配体S2.2中加入等量的CDNA得到混合液， 然后将混合液加热到95℃保持 5min后梯度降温， 使所述 适配体S2.2和CDNA形成双链 Ⅰ； S3、 用无酶消化液消化培养后的MCF ‑7细胞， 然后用结合缓冲液重悬所述MCF ‑7细胞并 进行计数， 得到 MCF‑7细胞样品； S4、 向所述MCF ‑7细胞样品中加入双链 Ⅰ， 37℃反应1h， 反应结束后得到反应产物 Ⅰ； 然后 向反应产物 Ⅰ中加入锁式探针和 T4DNA连接酶缓冲液， 再向其中加 入T4 DNA连接酶， 并在16 ℃环境下反应16h， 反应完成后， 升温至65℃保持10min灭活酶， 使锁式探针的5 ’端和3’端连 接形成环状DNA， 获得反应产物 Ⅱ； S5、 向反应产物 Ⅱ加入Phi 29DNA聚合酶、 dNTPs、 BSA和Phi29DNA聚合酶缓冲液， 并在37 ℃环境下反应1h， 然后升温至65℃保持10min灭活酶， 反应结束后得到产物 Ⅲ， 即串联重复 的G四链体单链； S6、 在所述产物 Ⅲ中加入荧光染料Tb3+， 然后用荧光 分光光度计检测荧光， Ex＝290nm， Em ＝450nm‑560nm， 狭缝为5nm。 2.根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增反应检测肿瘤细胞的方法， 其特征是： 步骤 S4所述的锁试探针包括依次连接的5 ’端序列、 中间序列和3 ’端序列， 且所述5 ’端序列和3 ’ 端序列分别与中间序列之间连接有间隔序列； 所述5 ’端序列和3 ’端序列分别与所述CDNA互 补； 所述中间序列 与所述G四链体单链为互补序列。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114509568 A 2一种基于滚环扩增反 应检测肿瘤细胞的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 生化检测和分子诊断领域， 尤其涉及 一种基于滚环扩增反应检测肿瘤 细胞的方法。 背景技术 [0002]2020年全球癌症新发病例数近2000万例， 死亡病例数近1000万例， 乳腺癌新发病 例数226万例， 首次超过肺癌， 成为全球 “第一癌”。 虽然在常规治疗局限性乳腺癌方面取得 了重大进展， 但是治疗转移性乳腺癌仍然是一个巨大挑战， 因为绝大多数死亡是 由于癌细 胞在远处器官的转移扩散造成的。 如何发现早期转移的的肿瘤细胞对乳腺癌的诊断治疗预 后都有重要作用， 肿瘤组织发生转移进入血液的稀有细胞被称为循环肿瘤细胞 (circulating  tumor cells CTC)。 血液中存在高背景的红细胞白细胞， 据报道 每毫升血液 中仅有几个至几十个的CTC， 检测 CTC主要挑战是外周血中数量稀少及通过CTC与血细胞之 间分子异质性分离的方法多少存在局限。 [0003]如今CTC捕获分离、 富集和检测技术主要有根据其物理特性或者其表面分子标志 物发展的如CellSearch系统、 免疫染色、 流式细胞术、 分子分析(RT ‑PCR)等方法， CellSearch系统是美国食品和药物管理局(FDA)批准的唯一一种 CTCs检测方法， 但是该系 统只能识别表达上皮标志物的CTC亚群， 而不能检测到另一部 分发生上皮 间质转换(EMT)的 细胞， 适用范围不广， 在临床上没有得到广泛推广， 其他检测方法因为方法操作和应用的局 限性在CTC检测应用上仍需作出很大改进。 [0004]因此， 发展高灵敏度、 简单、 快速的CTC检测技术是现在液体活检技术的热门研究 方向， 有助于为临床上癌症的早期诊断， 靶向治疗， 评估预后提供重要信息 。 [0005]为了解决上述问题， 在现有技术的基础上提供了一种基于滚环扩增反应检测肿瘤 细胞的方法。 发明内容 [0006]本发明的目的是提供一种基于滚环扩增反应检测肿瘤细胞的方法， 本发明通过把 靶细胞的数量信号转化为滚环扩增反应扩增出的大量串联重复G四链体敏化的Tb3+信号， 灵 敏度高， 是一种可观的检测肿瘤 细胞数量的方法。 [0007]本发明的上述 技术目的是通过以下技 术方案得以实现的： [0008]一种基于滚环扩增反应 检测肿瘤 细胞的方法， 步骤如下： [0009]S1、 筛选出特异性结合MUC1的适配体S2.2， 并设计与所述适配体S2.2部分互补的 核酸链CDNA； [0010]S2、 向所述适配体S2.2中加入等量的CDNA得到混合液， 然后将混合液加热到95℃ 保持5min后梯度降温， 使所述 适配体S2.2和CDNA形成双链 Ⅰ； [0011]S3、 用无酶消化液消化培养后的MCF ‑7细胞， 然后用结合缓冲液重悬所述MCF ‑7细 胞并进行计数， 得到 MCF‑7细胞样品；说　明　书 1/4 页 3 CN 114509568 A 3