ICS 65.020.99 CCS B40 4117 驻 马 店 市 地 方 标 准 DB 4117/T 320—2021 动物病原微生物实验室菌种保存和活化 技术指南 2021 - 09 - 29 发布 2021 - 10 - 29 实施 驻马店市市场监督管理局 发 布 DB 4117/T 320—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由驻马店市畜牧局提出。 本文件归口于驻马店市畜牧兽医标准化技术委员会。 本文件起草单位：驻马店市兽药饲料（动物产品）质量检验监测中心、许昌市建安区动物疫病预防 控制中心、许昌市动物疫病预防控制中心、新蔡县农业综合行政执法大队、三门峡市陕州区农业农村局、 上蔡县农业综合行政执法大队、许昌市建安区动物卫生监督所、上蔡县卧龙街道办事处社区服务中心、 确山县动物卫生监督所、上蔡县农业综合行政执法大队、泌阳县动物卫生监督所、泌阳县动物疫病预防 控制中心、平顶山市畜产品质量安全监测中心、遂平县农业农村局动物卫生监督所、上蔡县农业综合行 政执法大队、驻马店市农业农村局、西平县农业农村局农业综合行政执法大队、平舆县农业农村局、遂 平县农业农村局、驻马店市动物疫病预防控制中心、驻马店市质量技术监督检验测试中心、正阳县兽药 饲料质量检验监测中心、西华县动物卫生监督所。 本文件主要起草人：马宁、曹世杰、葛会杰、陶相宇、李佳佳、刘建华、王建军、侯明阳、李永峰、 苏高莉、李超、吴大会、邱孜博、时海燕、张友超、陈玉霞、张琛、张峰、王旺、郑丰、常清华、汪景 慧 、孙政豪、罗少伟。 本文件为首次发布。 I DB 4117/T 320—2021 动物病原微生物实验室菌种保存和活化 技术指南 1 范围 本文件规定了动物病原微生物实验室常用的菌种保藏和活化的术语和定义、要求、标准菌株菌种获 取、菌种保存、菌种活化和记录。 本文件适用于动物病原微生物实验室菌种的保存和活化。 本文件所述动物病原微生物实验室以下均简称为实验室。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27025 检测和校准实验室能力的通用要求 GB/T 27476.1 检测实验室安全 第1部分：总则 SN/T 2660 食品微生物实验室菌种保藏方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 菌种 可以培养的有一定科学意义或实用价值的细菌、真菌、病毒、细胞等代表株。 3.2 样本 人工采集的、经鉴定具有保藏价值的含有动物病原微生物的体液、组织、排泄物、分泌物、污染 物等物质。 3.3 病原微生物 能够使人或者动物致病的微生物。 3.4 菌种保存 将微生物菌种用各种适宜方法妥善保存，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。 3.5 菌种活化 菌种活化就是将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，逐级扩大培养得到纯而壮的培养物。 1 DB 4117/T 320—2021 3.6 标准菌株 直接从有资质的菌种保藏机构获得并至少定义到属或种的水平的菌株，按菌株特性进行分类和描述。 3.7 代 将微生物接种至新鲜培养基上或其中，每萌发一次即称一代，未开启原包装的标准菌株通常视为第 0 代。 4 基本要求 4.1 动物病原微生物的保存和活化应符合《实验室 生物安全通用要求》等国家强制标准及相关政策法 规要求。 4.2 针对动物病原微生物菌种特性选择适宜的保存方法，宜采用两种或两种以上的方法保存，以保持 菌种的原有性状稳定和避免损失。 4.3 动物病原微生物菌种保存所使用的器皿要求清洁、透明、无破损、无裂痕。 4.4 根据动物病原微生物菌种保存需要选择适合培养基。 4.5 动物病原微生物菌种保存过程中应注意无菌操作，避免污染。 4.6 动物病原微生物菌种培养至稳定期或成熟期后进行保存。 4.7 动物病原微生物菌种保存期间，要定期检查菌种存放设施的温度和湿度、菌株有无污染、绵塞有 无霉变，如有异常应重新移植培养后更换。 4.8 动物病原微生物菌种保存工作不能对周围环境造成污染和危害。 5 标准菌种获取 5.1 获取途径 5.1.1 标准菌种的获取可通过国家级菌种保藏中心或省级保藏中心获取。 5.1.2 从上级机构下发的质控盲样中分离出的菌株，被证明结果是正确的、且从考核机构获得该菌种 的保藏机构名称缩写及菌种编号的，也可作为标准菌株使用。 5.1.3 从其他有效的，经过资质认证的商业机构获得原包装的标准菌种。 5.2 验收 实验室应制定标准菌株验收控制程序，确认供货商资质及来源，确保所获取的标准菌株满足要求。 5.3 标准菌种保存 通常情况下，应按照制造商提供的使用说明进行保存。 6 工作菌种保存方法 6.1 定期移植法 6.1.1 适用范围 适用于大多数细菌和真菌。 2 DB 4117/T 320—2021 6.1.2 操作步骤 定期移植方法操作步骤如下： a) 接种：以无菌操作将菌株纯培养物接种到固体培养基（斜面）或液体培养基中，接种固体培 养基可采用点接、划线或穿刺等方法。 b) 培养：在所保存菌种的最适培养条件下将细胞培养至稳定期或成熟期，并进行纯度检查。 c) 保存：培养好的菌种于 4 ℃～6 ℃保存，需室温保存的菌种在室温（25 ℃）下保存。保存培 养基一般含较多的有机氮，糖分总量不超过 2%。 6.1.3 保存周期 每3-6个月移植一次。有特殊要求的按其规定移植。易保存于相对湿度为50 %～70 %的环境中。 6.2 液体石蜡法 6.2.1 适用范围 适用于部分在有氧状态下生产良好的细菌、酵母、霉菌及放线菌。 6.2.2 操作步骤 液体石蜡法操作步骤如下： a) 灌入石蜡：将无菌的液体石蜡在无菌条件下注入刚培养好的新鲜培养斜面培养物上，液面高 于斜面顶部 1 cm 左右，使菌体与空气隔绝。 b) 保存：注入液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温（4 ℃～6 ℃）干燥处保存，需室温保存 的菌种在室温（25 ℃）下保存。 6.2.3 保存周期 保存时间为2-10年。保存期间应定期检查，当液体石蜡减少露出培养基斜面时，应及时补充灭菌的 液体石蜡。如发现异常应重新培养后补上空缺。 6.3 冷冻干燥保存法 6.3.1 适用范围 本方法适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次氏体、部分丝状真菌和酵母菌等的保存。 6.3.2 操作步骤 冷冻干燥保存法操作步骤如下： a) 菌种准备：在所保存菌种的最适培养条件下将细胞采用斜面培养、液体培养等方式培养至稳 定期或成熟期，进行纯度检查后与保护剂混合均匀，分装。 b) 分装：分装菌液应在无菌条件下操作。采用较长的滴管，直接将菌液滴入安瓿管或冻存管底 部，每管分装量约 0.1 mL～0.2 mL。若是球形安瓿管，装量为半个球部。分装后用脱脂棉堵 住安瓿管管口，注意不要过紧或过松。分装时间尽量要短，最好在 1 h～2 h 内分装完毕并预 冻。 c) 预冻：一般预冻 2 h 以上，温度达到-40 ℃左右。 3 DB 4117/T 320—2021 d) e) f) 冷冻干燥：将预冻后的样品安瓿瓶迅速置于已充分预冷的冷冻干燥机样品舱内按照程序冷冻 干燥。完毕后取出样品管置于干燥器内，备用。冷冻干燥时间一般为 8 h～20 h。 安瓿管封口及真空检验：从干燥器中取出冷冻干燥完全的安瓿管，在距管口 5 cm 左右用喷射 火焰将管拉细后将管口连接到与真空安瓿管泵相连的橡皮管上，打开真空泵，在真空下用喷 射火焰对准管细颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪检验真空度。 保存：封口完全的冷冻干燥管保存于 4 ℃～10℃。 6.3.3 保存周期 一般在10年左右。 6.4 瓷珠保存法 6.4.1 适用范围 适用于大多数微生物，如噬菌体、放线菌、丝状真菌、霉菌等的保存。 6.4.2 操作步骤 瓷珠保存法操作步骤如下： a) 将直径为 2 mm～3 mm 的瓷珠分装到小螺帽瓶中制成冷冻管，高压灭菌。 b) 在无菌状态下打开冷冻管，在所保存菌种的最适培养条件下降细胞培养至稳定期或成熟期， 进行纯度检查后，将菌种新鲜培养物加入到培养基中制成混悬液，无菌操作将混悬液转入到 冷冻管中。 c) 封好冷冻管颠倒四至五次乳化菌种培养基混悬液。切勿涡旋振荡。 d) 菌种吸附于瓷珠上后，将多余的混悬液吸出；如使用商业化的细胞冻存管，此时应按照产品 说明书进行操作。 e) 保存：将冷冻管存于-70 ℃。 6.4.3 保存周期 可保存10年。 7 菌种活化 7.1 标准菌种活化 将标准菌种按说明书要求转种于适当的培养基内，于适当温度下培养适当时间，进行复苏。宜将标 准菌种悬浮于营养肉汤中进行复苏。 7.2 保存菌种活化 7.2.1 定期移植法保存菌种取样后直接接种于固体培养基或适量的液体培养基中进行活化。 7.2.2 液体石蜡法保存菌种恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜培养基上，生长繁殖获得第 1 代菌 种后，挑取单菌落再重新转接一次。 7.2.3 冷冻干燥法保存的菌种复苏先用 70 %酒精棉擦拭管的上部，用玻璃刀划开管顶端，用灭菌水或 培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基，进行培养。 4 DB 4117/T 320—2021 7.2.4 瓷珠保存法保存菌株在无菌条件下打开冷冻管，用无菌针或接种环取出一粒瓷珠。封好冷冻管 并尽快将其送回低温条件下保存。将瓷珠直接接种于固体培养基或适量的液体培养基中。 8 记录 8.1 微生物菌种保藏和使用应建立保存期内菌种的收集、储藏、保存及确认试验的记录。记录中还应 包括（但不局限于）以下内容：从原始菌种传代到工作菌种的代数；菌种生产的培养基及孵育条件；菌 种生存条件。 8.2 实验室应建立完善的技术资料档案，详细记录所保存的菌种和样本的名称、编号、数量、来源、 病原微生物类别、主要性状、保存方法、保存时间等信息。技术性资料档案应当永久保存。 5