ICS 65.080 B 13 备案号： 江 DB32 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3628—2019 木霉固态菌种生产技术规程 Technical regulation for production of solid Trichoderma spp. spawn 2019 -07 -11 发布 江苏省市场监督管理局 2019 -08 -01 实施 发 布 DB32/T 3628—2019 前 言 本标准按GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由南京农业大学提出并归口。 本标准起草单位：南京农业大学。 本标准主要起草人：沈其荣、刘东阳、黄启为、李荣、凌宁。 I DB32/T 3628—2019 木霉固态菌种生产技术规程 1 范围 本标准规定了木霉固态菌种生产中所涉及的生产场地要求、生产流程、产品检测、建立生产档案、 包装及贮存运输要求等技术环节。 本标准适用于木霉固态菌种的生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 191 包装储运图示标志 GB 3095 环境空气质量标准 GB 3838 地表水环境质量标准 GB 20287 农用微生物菌剂 NY/T 883 农用微生物菌剂生产技术规程 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 固态菌种 solid spawn 生长在固态培养基料上的菌种。 3.2 微生物接种剂 microbial inoculant 一种或一种以上的目的微生物经工业化生产增殖后直接使用，或经浓缩或经载体吸附而成的活菌制 品。 3.3 固体培养基 solid medium 以富含木质纤维素或淀粉类天然物质为主要原料，添加适量的有机氮源及无机盐类，具一定水分含 量的培养基。 4 生产场地要求 1 DB32/T 3628—2019 4.1 生产基地选择 生产基地应远离居住区、城区等，并且交通便利，生态环境优良，周边植被覆盖率高。生产地块集 中连片并位于原料收集区较近的地方。车间保温保湿性能良好，同时具备通风性能。 4.2 生产环境 厂区空气质量达到大气环境质量标准GB 3095中II类标准要求。 发酵用水达到地表水质量标准GB 3838中III类水质要求，冷却水及其他用水应达到标准IV类水质要 求。 4.3 生产车间 4.3.1 原料库 原料库要求水电方便，平坦干燥、通风良好，光照充足、空旷宽阔，远离火源，注意防火设施的建 设。 4.3.2 接种室 接种室必须设缓冲间，通风和保温性能良好，并具有防尘换气性能，墙内壁和屋顶光滑，必须做好 杀菌消毒工作，确保接种室环境的相对无菌。 4.3.3 培养室 培养室内壁和屋顶光滑，便于清洗与消毒，有条件的单位可以建设半地下室的培养室，或者将培养 室墙壁加厚，有利于培养室的控温。 4.3.4 检验室 检验室宜留出便于检验仪器设备安装的场所，同时水电布局要求合理，建立车间环境卫生制度，定 期对生产设备和环境消毒的。 5 生产流程 5.1 技术环节 木霉固态菌种主要包括木霉高密度液体发酵、固体基质准备、接种木霉液体菌种、固体发酵的控制、 固态菌种后处理、产品包装、质量检测及出厂等技术环节。具体工艺流程见附录A。 5.2 菌种要求 5.2.1 原种 原种是生产用菌种的母种，对原种有如下要求： ——原种应有菌种鉴定报告。 ——原种应有菌种的企业编号、来源信息等。 5.2.2 菌种保管 采用固体曲保藏和冻干管保藏的方法保藏木霉固体孢子，确保无杂菌污染，菌种不退化。分类纯化 并定期检查，建立菌种档案。 2 DB32/T 3628—2019 5.2.3 菌种质量控制 在进行生产之前，应对所使用的菌种进行检查，并确认其纯度和性能没有发生退化，如出现污染或 者退化情况，该菌种不能作为生产用菌种，应该按照标准NY/T 883执行。 5.3 液体发酵增殖 木霉菌种的液体发酵增殖，按照NY/T 883执行。具体的培养基见附录B。 木霉菌丝体采用棉兰染色法观察：在载玻片中央滴加一滴无菌水，并将菌丝体均匀分布其中，盖上 盖玻片，尽量不留气泡，从一侧滴加少量的棉兰染色液染色5 min，染色结束后用无菌水慢慢冲洗染色 液，表面风干后在显微镜下观察，染色液配方具体见附录C。菌丝清晰可见，生长良好，没有出现杂菌 污染，可以作为菌种继续使用；如果菌丝细小并呈不规则分布或者有杂菌污染，应按标准NY/T 883处 理。 5.4 固体培养基制备 5.4.1 培养基要求 发酵培养基要求接种后木霉菌丝体生长旺盛，在保证有一定的生物量（菌丝体）的前提下兼顾分生 孢子及有效代谢产物的产生。 原料要求来源充足、价格合理、营养成分充足，宜采用农作物秸秆及农用氨基酸作为主要原料。 5.4.2 制备过程 5.4.2.1 秸秆前处理 以农作物秸秆作为发酵基质，使用前晾干（含水率约15%，含有机质约65%）并用粉碎机将其粉碎 成0.3 cm～0.4 cm长的片段。 5.4.2.2 氨基酸添加 往上述秸秆中添加氨基酸稀释液，氨基酸稀释液的添加量为每100 g晒干后的秸秆加入100～200 mL 的氨基酸稀释液（氨基酸原液总氨基酸含量≥10%），调节起始pH为3.0～4.0，物料的含水率应该严格 控制在50%～60%之间，陈化4 h～6 h后备用。 5.4.3 灭菌 5.4.3.1 高压蒸汽灭菌要求 固体发酵培养基物料灭菌温度为121℃～130℃，灭菌时间为1.0 h～2.0 h；或者采用100℃灭菌2 h～ 4 h，24 h后再灭菌一次。 5.4.3.2 灭菌效果检测 将1 g固体发酵产物加入到9 mL无菌水中，充分混匀后制成悬液，吸取1 mL悬液加入到装有已灭菌 的9 mL营养肉汤的试管中，并做至少三个生物学重复，将试管置于37℃恒温培养箱中避光培养，24 h 内无浑浊、镜检无菌体后即可判定彻底灭菌，反之则判定为灭菌不彻底，不可用于固体发酵。 5.5 接种 3 DB32/T 3628—2019 固体发酵培养基高温蒸汽灭菌后，待其降至室温，尽快将灭好菌的固体发酵培养基转移至固体发酵 培养室。将发酵好的木霉菌丝体按5%的接种量（v/w，鲜重）接种到固体发酵培养基料中并充分拌匀， 分装到不同的浅盘当中，并将塑料浅盘转移到具有控温控湿功能的发酵室内进行培养。 5.6 发酵控制 5.6.1 培养温度 固体发酵的温度应该严格控制在（28±2）℃，根据不同木霉发酵特性和生长代谢特征，适当调整 到最佳的发酵温度。 5.6.2 物料含水率 固体发酵初期，最适宜的物料含水率应该控制在50%～60%之间，发酵结束后，发酵产品的含水率 应该控制在20%～40%之间。 5.6.3 空气湿度 固体发酵过程中，空气湿度宜严格控制在70%～75%之间。 5.7 发酵终点判断 5.7.1 物理性状 采用感观法评价固体发酵物料的颜色、形态和气味。 5.7.2 孢子定量 5.7.2.1 稀释涂布 以无菌操作取样25 g转至225 mL无菌生理盐水中，并充分震荡后制成1：10的菌悬液。并利用梯度 稀释法进行样品稀释，吸取最后的稀释液0.1 mL于木霉选择性培养基上（见附录B），并用涂布棒将菌 悬液涂布均匀。 5.7.2.2 培养 在28℃恒温培养箱中避光培养2 d～3 d，注意观察菌落的生长情况。 5.7.2.3 计数 ——记录各平板的菌落总数，求出不同稀释度平板中的平均菌落数，计算出每克原始样品中的菌落 数。 ——固体发酵产物中有效活菌数含量≥4.0×109个/克。 6 产品检测 6.1 有效活菌数检测 按照5.7.2的方法检测发酵产物中的有效活菌数。 6.2 杂菌率检测 杂菌率的检测按照GB 20287执行，木霉固体发酵产物的杂菌数应≤1.0×104个/克。 4 DB32/T 3628—2019 6.3 其他项目检测 固体发酵物的细度、有害元素含量（Hg、Pb、Cd、Cr、As）、pH（5.5～7.5）、大肠杆菌数、蛔 虫卵死亡率值达到NY/T 883的要求。 7 建立生产档案 每批次生产的产品，必须建立完善的生产档案，包括产品检验项目、检验结果、实验人、批准人以 及检验日期等准确信息。 8 包装及贮存运输要求 8.1 包装 包装标签按 GB/T 191规定执行。 8.2 贮存 产品应贮存于阴凉干燥处，环境温度不宜超过30℃，并避免与化肥、农药等一同贮存。 8.3 运输 在运输过程中应注意防潮、防晒、防破裂。 5 DB32/T 3628—2019 附 录 A （规范性附录） 木霉固态菌种生产技术规程示意图 发酵原种 污染 退化 原种复壮 菌种纯度检测及其功能分析 原种纯化 发酵过程的 优化与控制 液体菌种 的检测 按规定处理 检测不合格 检测合格 固体发酵过程 中发酵参数的 优化与控制主 要包括 pH、 含水率、发酵 时间等 固体菌种包装 质量检验 检测不合格 检测合格 按规定处理 出厂 6 DB32/T 3628—2019 附 录 B （规范性附录） 培养基及其配方 原种培养基及其配方：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基），其中马铃薯200 g煮沸后取滤液， 葡萄糖20 g，琼脂25 g，水1000 mL，pH调整为5.0。 摇瓶种子培养基及其配方：马铃薯葡萄糖液体培养基，其中马铃薯200 g煮沸后取滤液，葡萄糖20 g， 水1000 mL，pH调整为5.0。 液体发酵培养基及其配方：土豆150 kg/T、蔗糖15 kg/T、玉米粉5 g/T、(NH4)2SO4 5 kg/T、MgSO4·7H2O 0.5 kg/T、KH2PO4 1kg/T、pH自然；pH调整为5.0。 固体发酵培养基：农作物秸秆（优选水稻秸秆和玉米秸秆，含水率约15%，含有机质量约65%）晾 干后用粉碎机将其粉碎成0.3 cm～0.4 cm长的片段；往上述秸秆中添加氨基酸稀释液，氨基酸稀释液的 添加量为每100 g晒干后的秸秆加入100 mL～200 mL的氨基酸稀释液（相当于100 g晒干后的秸秆中加入 10 mL～20 mL的氨基酸水解液原液，氨基酸原液中总氨基酸的含量≥10%），调节起始pH为3.0～4.0， 初始含水率严格控制在50%～60%之间，陈化4 h～6 h后备用（可以对秸秆进行预处理，更利于木霉利 用秸秆）。 木霉选择性培养基：蛋白胨5.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L，琼脂20.0 g/L，孟加拉红0.033 g/L；上述培养基使用前，加入氯霉素0.1 g/L，五氯硝基苯（75%可湿性粉剂）0.2 g/L， 1%链霉素（w/v）9mL，霜霉威0.