ICS 11.020 C 50 DB61 陕 西 省 地 方 标 准 DB 61/ T 1001.2—2015 保健用品微生物限度检查 第 2 部分： 菌落总数测定 Microbial limit examination for healthcare supplies Part 2: Tests for bacterial colony count 2015-12-29 发布 陕西省质量技术监督局 2016-03-01 实施 发 布 DB61/T 1001.2—2015 目 次 前言 ................................................................................ II  1 范围 .............................................................................. 1  2 规范性引用文件 .................................................................... 1  3 术语和定义 ........................................................................ 1  4 设备和材料 ........................................................................ 1  5 培养基和试剂 ...................................................................... 1  6 操作步骤 .......................................................................... 2  7 结果和报告 ........................................................................ 3  I DB61/T 1001.2—2015 前 言 DB61/T 1001《保健用品微生物限度检查》分为以下5个部分： ——第1部分：总则； ——第2部分：菌落总数测定； ——第3部分：铜绿假单胞菌检验； ——第4部分：金黄色葡萄球菌检验； ——第5部分：霉菌和酵母菌数测定。 本部分为DB61/T 1001的第2部分。 DB61/T 998《保健用品安全性评价指导原则及试验方法》与DB61/T 999《保健用品功能学评价指导 原则及试验要求》、DB61/T 1000《保健用品产品标准编写规范》、DB61/T 1001《保健用品微生物限度 检查》共同构成了陕西省保健用品系列地方标准。 下面列出了这些地方标准的结构： a) DB61/T 998《保健用品安全性评价指导原则及试验方法》分为以下 6 个部分： 1) 第 1 部分：安全性评价指导原则； 2) 第 2 部分：皮肤急性毒性试验； 3) 第 3 部分：皮肤长期毒性试验； 4) 第 4 部分：皮肤刺激性试验； 5) 第 5 部分：皮肤过敏性试验； 6) 第 6 部分：眼部刺激性试验。 b) DB61/T 999《保健用品功能学评价指导原则及试验要求》分为以下 16 个部分： 1) 第 1 部分：总则； 2) 第 2 部分：改善微循环类功能学评价动物试验； 3) 第 3 部分：改善微循环类功能学评价人体试验； 4) 第 4 部分：乳房保健类功能学评价动物试验； 5) 第 5 部分：乳房保健类功能学评价人体试验； 6) 第 6 部分：胃肠功能保健-助消化类功能学评价动物试验； 7) 第 7 部分：胃肠功能保健-助消化类功能学评价人体试验； 8) 第 8 部分：胃肠功能保健-通便类功能学评价动物试验； 9) 第 9 部分：胃肠功能保健-通便类功能学评价人体试验； 10) 第 10 部分：皮肤瘙痒类功能学评价动物试验； 11) 第 11 部分：皮肤瘙痒类功能学评价人体试验； 12) 第 12 部分：妇女卫生保健类功能学评价动物试验； 13) 第 13 部分：妇女卫生保健类功能学评价人体试验； 14) 第 14 部分：眼部保健类功能学评价人体试验； 15) 第 15 部分：改善睡眠、醒脑通窍保健类功能学评价动物试验； 16) 第 16 部分：改善睡眠、醒脑通窍保健类功能学评价人体试验。 c) DB61/T 1000《保健用品产品标准编写规范》分为以下 8 个部分： 1) 第 1 部分：总则； II DB61/T 1001.2—2015 2) 第 2 部分：保健贴类产品标准编写规范； 3) 第 3 部分：眼贴类产品标准编写规范； 4) 第 4 部分：含药芯类产品标准编写规范； 5) 第 5 部分：喷涂类产品标准编写规范； 6) 第 6 部分：清洗液类产品标准编写规范； 7) 第 7 部分：器具类产品标准编写规范； 8) 第 8 部分：功能服装类产品标准编写规范。 本部分根据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本部分由陕西省食品药品监督管理局提出并归口。 本部分起草单位：陕西省食品药品监督管理局、陕西省质量技术监督局。 本部分主要起草人：杨晓莉、乔蓉霞、李伟、张扬。 本部分由陕西省食品药品监督管理局负责解释。 本部分首次发布。 联系信息如下： 单位：陕西省食品药品监督管理局 电话：029-62288000 地址：西安市高新六路56号 邮编：710065 III DB61/T 1001.2—2015 保健用品微生物限度检查 第 2 部分：菌落总数测定 1 范围 DB61/T 1001的本部分规定了保健用品中菌落总数的测定方法。 本部分适用于陕西省的保健用品中菌落总数的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB61/T 1001.1-2015 保健用品微生物限度检查 第1部分：总则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 菌落总数 bacterial colony count 指保健用品经过处理，在一定条件下培养后（如涉及培养基成份、培养温度、培养时间、pH值、需 2 氧性质等因素），每1g、1mL或10cm 检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下 生长的嗜中温的需氧性菌落总数。 4 设备和材料 对保健用品送检样品进行菌落总数测定时，除应具备微生物实验室的常规灭菌和培养设备外，还应 配备以下设备和材料并符合其规定： a) 恒温培养箱：温度应控制在 36℃±1℃； b) 冰箱：温度应控制在 2℃～5℃； c) 恒温水浴箱：温度应控制在 46℃±1℃； d) 天平：感量为 0.1g； e) 振荡器； f) 均质器； g) 无菌吸管 1mL（具 0.01mL 刻度）、10 mL（具 0. 1mL 刻度），或微量移液器及吸头； h) 无菌锥形瓶：容量为 250mL 或 500 mL； i) 无菌培养皿：直径为 90mm； j) pH 计或精密 pH 试纸； k) 放大镜或/和菌落计数器。 5 培养基和试剂 1 DB61/T 1001.2—2015 5.1 无菌生理盐水 无菌生理盐水应符合DB61/T 1001.1-2015中3.6.3规定的要求。 5.2 卵磷脂、聚山梨酯 80-营养琼脂培养基制备 应先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入聚山梨酯80，将除琼脂外的其他成份加入剩余的 蒸馏水中进行溶解。再加入已溶解的卵磷脂、聚山梨酯80，混匀，调节pH值至7.1～7.4，灭菌，储存于 冷暗处备用。其中，各制备材料的种类及量应符合以下要求： a) 蛋白胨：20g； b) 牛肉膏：3g； c) 氯化钠：5g； d) 琼脂：15g； e) 卵磷脂：1g； f) 聚山梨酯 80：7g； g) 蒸馏水：1000mL。 5.3 0.5％氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride，TTC）制备 应称取0.5g TTC、100mL蒸馏水，将其溶解后过滤，灭菌，装于棕色试剂瓶，置于4℃冰箱备用。 6 操作步骤 6.1 6.1.1 样品的稀释 应按照 DB61/T 1001.1-2015 中 4.4 的规定制备 1：10 样品匀液。 6.1.2 应称取 1mL 的 1：10 样品匀液沿管壁缓慢注于盛有 9mL 无菌生理盐水的试管中（注意吸管不得 接触液面），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1：100 样品匀液。 6.1.3 应按照 6.1.2 规定的要求，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增一次，应换用 1 次 1mL 无菌吸 管或吸头。 6.1.4 应根据对样品污染状况的估计，选择 2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）， 在进行 10 倍递增稀释时，吸取 1mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度应至少做两个平皿。同时，应 分别吸取 1mL 空白稀释液加入两个平皿内作空白对照。 6.1.5 应及时将 15mL～20mL 冷却至 46℃的卵磷脂聚山梨酯-80 营养琼脂培养基（可放置于 46℃±1℃ 恒温水浴箱中保温）倾注于平皿，并转动平皿使其混合均匀。 6.2 6.2.1 培养 应在琼脂凝固后翻转平板，并在 36℃±1℃条件下培养 3d。 6.2.2 为便于区别样品中的颗粒与菌落，可在每 100mL 卵磷脂聚山梨酯 80-营养琼脂中加入 1mL 0.5％ 的 TTC 溶液：若有细菌存在，则培养后菌落呈红色，而样品的颗粒颜色无变化。 6.3 菌落计数方法 6.3.1 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，并应记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计 数应以菌落形成单位（colony-forming units，即 CFU）表示。 2 DB61/T 1001.2—2015 6.3.2 应选取菌落数在 30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。对于菌落数低 于 30 CFU 的平板应记录其具体菌落数，对于菌落数大于 300 CFU 的平板可记录为“多不可计”。每个 稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数计数。 6.3.3 若其中一个平板有较大片状菌落生长，则不宜采用该平板计数菌落数，而应采用无片状菌落生 长的平板计数该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半的菌落分布又很