ICS 71.100.70 C2682 Y42 上海日用 化学品行业协会 团体标准 T/SHRH 00 9-2018 _________________________________________________________________________________________ 化妆品 - 3D皮肤模型彗星实验 方法 Cosmetics -3D Skin Comet Assay 2018-12-01发布 2018-12-30实施 上海日用化学品行业协会 发布 1 目 次 前言…………………………………………………………………………… ……………… 2 1.范围…………………………………………………………………………… …………… 3 2.规范性引用文件 ……………………………………………………… …………… ……… 3 3. 原理………………………………………………… …………………… ………………… 3 4.试剂和材料 ………………………………………………………… ………………… …… 3 5 .仪器和设备 …………………………………………… ………… ………………………… 4 6.实验步骤 ………………………………………………………………………………… … 5 7.结果判定 ………………………………………………………………………………… … 6 8.结果报告 …………………………………………………………………………………… 6 2 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009给出规则起草。 本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。 本标准起草单位： 汉高（中国）投资有限公司、 上海家化联合股份有限公司、 伽蓝（集团）股份有 限公司、上海相宜本草化妆品股份有限公司 、上海中翊日化有限公司 、上海市质量监督检验技术研究院 、 玫琳凯（中国） 有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、上海清轩生物科技有限公司 有限公司、 广 东博溪生物科技有限公司、 东阿阿胶股份有限公司 、上海日用化学品行业协会 。 本标准主 要起草人： 田丽婷、张萌萌 、陈田、吴建铭、吕智、 孙培文、 林艺青、 戴彦韵、万向红、 李琼、高宏旗 、金坚、陈亦华 3 化妆品-3D皮肤模型彗星实验 方法 1 范围 本标准规定了 3D皮肤模型彗星实验的基本技术要求。 本标准适用于评价化妆品、家用洗护用品的研究、生产加工、保存和运输过程中所涉及原料、中间 体等的DNA损伤。检验对象包括但不限于上述领域的多种化合物等。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 3 原理 为使用彗星试验研究 DNA损伤，经过细胞分离、细胞膜与核膜分离、去除蛋白等过程后， 在高碱性 条件下，使聚缩的 DNA解旋。将玻片转移至电泳槽中，在此处，带负电的 DNA根据其分子大小在电场中迁 移。其后，对 DNA染色，在荧光显微镜下观察。完整的 DNA（在电泳条件下不能迁移）表现为圆形细胞核。 相反，DNA片段 （使用供试化合物处理后出现的） 能够迁移。 这些 DNA片段肉眼可见，表现为在彗星头 （由 未迁移的 DNA构成）后面出现的彗星尾。可使用几种参数来测定彗星形成的幅度 ，进而判断受试物是否 为致突变物或致断裂物。 4 试剂和材料 4.1 丙酮 4.2 70%乙醇 4.3 乙醇＞96% 4.4 甲磺酸甲酯， MMS；5 µg/cm2；Sigma-Aldrich， 4.5 前致变剂阳性对照： 苯并芘（ BaP，12.5 µg/cm2，丙酮溶液； Sigma-Aldrich） 4.6 Aphidicolin （APC）：通过稀释制备好的 100 ×二甲亚砜储备液； Sigma-Aldrich 4.7 ToxiLight 生物检测试剂盒（ Lonza，Basel，Switzerland ） 4.8 TPlite试剂盒（ Perkin Elmer ，Waltham，MA） 4.9 嗜热菌蛋白酶溶液（ 0.5 mg/mL ，溶于含 有10 mM Hepes [pH 7.2 -7.5]，33 mM KCL ，50 mM NaCl 和7 mM CaCl 2的缓冲液中） 4.10 琼脂糖 4.11 裂解缓冲液（ 2.5 M NaCl 、0.1 M Na 2EDTA、0.01 M Tris、10% DMSO 和1% Triton X -100，溶解 在双蒸水中， pH 10） 4.12 缓冲液（ 0.4 M Tris 双蒸水溶液， pH 7.5） 4.13 SYBR 黄，在缓冲液 Tris-EDTA（10 mM Tris 和1 mM Na 2EDTA，溶于双蒸水中， pH 7.5）中稀释10000 倍 4.14 Phenion® FT 全厚度3D皮肤模型，该类组织具有如下特征： 1）由基于胶原基质（将成纤维细胞培 养在重构和天然的基质环境中）的结构稳定的真皮构成。 2）原代角质细胞源自与成纤维细胞相 同的人类捐献者，形成了完全分化的表皮组织； 3）该表皮组织包含人类天然皮肤中所观察到的 所有层，包括对皮肤屏障功能起关键性调节作用的角质层； 4）Phenion®FT 全厚度皮肤模型模拟 人类天然皮肤，具有代谢能力。 4 5 仪器和设备 细胞培养箱、荧光显微镜、低温冰箱（﹣ 80℃） 、液氮罐、超净工作台、电泳。 6 实验步骤 6.1 皮肤组织的处理 实验前，皮肤组织的培养基 应每隔一天换液一次。通过在 37℃和5%CO2条件下过夜培养，进行平衡 后，可将组织用于实验。 按16 µL/cm2（Phenion®FT：25 µL）的体积，将受试化合物局部应用 48小时，以便对受试化合物进 行可能的代谢处理。在首次给药后 24小时和45小时，将第二和第三小份受试化合物应用于相同的组织上 面。拟将后一个时点专门用于捕获可能会立即进行 DNA修复的损伤。每天，在临近每次给药前制备新鲜 的受试化合物溶液。 6.2 单细胞的分离 暴露48小时后，采取 500-µL的培养基，用于测定腺苷酸激酶活性（ 推荐使用ToxiLight生物检测试 剂盒） 。使用手术刀，剥取 25%的组织，并将其保存在 -80℃条件下，以便进行第二次细胞毒性测定。将 四分之一的组织用于研究细胞内的 ATP浓度（推荐使用ATPlite试剂盒） ，将使用细胞内的蛋白浓度对测 定结果进行标准化。 将余下的组织转移至嗜热菌蛋白酶溶液（ 0.5 mg/mL ，溶于含有 10 mM Hepes [pH 7.2-7.5]，33 mM KCL ，50 mM NaCl 和7 mM CaCl 2的缓冲液中）的顶部，以降解真皮与表皮之间的基底 膜。在4 ℃条件下孵育 2小时后，使用剪刀，从真皮上面剥离表皮 。 使用剪刀，分别分割各个部分（即表皮和真皮） ，分离出胶质细胞和成纤维细胞，即所谓的切碎过 程。在通过离心收集细胞 /细胞核之前，将缓冲液通过细网（孔径 40 µm） ，以去除较大的残余物。将沉 淀悬浮在低熔点琼脂糖中，将 75 µL 的混合物分布在玻片上（ 使用之前已用 1.0%正常熔点琼脂糖（溶于 PBS中）预先包被） 。 将玻片盖上盖玻片，以使均匀分布的琼脂糖在 4 ℃ 条件下凝固 3-5分钟。 按此方法， 每个部分制备三张玻片。 6.3 实验参数选择 6.3.1 溶解性研究 旨在找出两种推荐的溶剂的最大溶解浓度，即，丙酮和 70%乙醇（v/v，DI溶液） 。丙酮是首先推荐 使用的溶剂，而 70%乙醇（去离子水溶液， v/v）只有在受试化合物在丙酮中溶解度低于 1%（v/v）的情 况下才使用， 70%乙醇将明显提高受试物质的溶解度。通常，所有溶剂均不得诱导出细胞毒性，或与受 试化合物发生相互反应，或改变受试化合物的特点。将目标浓度分别设定为 10 mg/100 µL 或10%。通过 逐渐加入小份溶剂来确定溶解度有限的化合物的最大浓度 。 然后通过在试验结束时导致皮肤组织上出现 沉淀的最低剂量来 确定最大浓度。 可将溶液加热至 40 ℃ 和/或用超声进行处理来增加溶解度。 6.3.2 剂量范围探索试验 进一步明确溶解度研究中定义的最大浓度的细胞毒性。 推荐使用不超过 6.1.中规定的最大浓度的对 数量表。监测受试化合物的细胞毒性影响， 如细胞内三磷酸腺苷（ ATP）的浓度变化和在细胞受损时从 组织中释放进入培养基中的腺苷酸激酶活性。 6.3.3 主实验 根据剂量范围探索试验结果，进一步确认最大的测试浓度。至少 设定三种浓度 ，即低、中、高剂量 组。如果在初步试验中，已经缩小了剂量范围，则 推荐等距剂量范围（而不是对数剂量范围） 。此外， 须应用溶剂对照和阳性对照 （使用甲磺酸甲酯， MMS；5 µg/cm2） 。如果发现溶剂已能充分反映特定实验 室未处理组织的低背景 DNA损伤，则不应用阴性对照。 5 给药组和对照组的组织 于受试物 暴露48小时。在试验开始时首次给药后，在